布美他尼预先给药对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤影响-effect of bumetanide on focal cerebral ischemia-reperfusion injury in rats.docxVIP

IHCImmunohistochemistry免疫组化AQP4Aquaporin-4水通道蛋白4SPAKSTE20/SPS-1related,proline-alanine-richkinase压力反应蛋白激酶OSR1Oxidativestressresponsekinase苏氨酸激酶1MAPKSMitogen-activatedproteinkinases丝列原活化蛋白激酶CaMKⅡCalcium/calmodulin-dependentproteinkinasesII钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ布美他尼预先给药对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影响专业：麻醉学研究生：王根保导师：黄焕森主任医师广州医学院第二附属医院麻醉科中文摘要研究背景与目的在脑缺血病理生理过程中，脑水肿与脑缺血后的致残率、死忘率及神经功能的恢复密切相关。因此，如何采取有效措施预防和减轻脑缺血再灌注损伤所致脑水肿是非常值得关注的问题。传统的观点认为，脑水肿主要是由于能量耗竭、钙超载以及血脑屏障的破坏所致。新的研究认为，脑水肿还和病理性刺激引起离子通道转录因子和转运蛋白上调有关。阳离子氯离子联合转运蛋白（CationChlorideCotransporter,CCC）是一组转运氯离子、钾离子和/或钠离子进出细胞的膜蛋白。CCC具有离子分泌、液体平衡、容量调整等多种生理作用。Na+-K+-2Cl-协同转运蛋白（Na+–K+–Cl-cotransporters,NKCC）是阳离子氯离子联合转运蛋白的一个亚型，被证实在动物的许多组织和细胞上有表达，迄今为止，已证实NKCC有两种亚型（NKCC1和NKCC2）,NKCC1组织分布广泛，在中枢神经系统，NKCC1在神经元、神经胶质细胞和少突胶质细胞都有表达，特别是大脑皮层的锥体细胞，而NKCC2只表达在肾脏组织。生理情况下，它在这些细胞的功能是转运K+、Na+和Cl-进入细胞形成电化学平衡，且NKCC1的活性受细胞内Cl-浓度调节，从而帮助保持正常细胞容积，对抗细胞外渗透压和细胞内溶质浓度的改变，防止细胞的过度膨胀和邹缩，并且该蛋白能特异性地被髓袢利尿剂呋噻米（速尿）和布美他尼所抑制。布美他尼是作用于髓袢升支粗段,干扰K+-Na+-2Cl-协同转运蛋白,产生强大的利尿作用的高效利尿剂。除利尿作用外，在体外实验研究表明，布美他尼通过抑制NKCC1能显著减少氧-葡萄糖剥夺和谷氨酸盐介导的兴奋性中毒的神经元凋亡。也有研究表明，NKCC1与脑水肿的形成密切相关，布美他尼通过抑制NKCC1能够减轻局灶性脑缺血水肿的程度及神经细胞损害。以往研究多通过微透析针持续大脑局部给药的方式，而且多集中在脑缺血再灌注早期，但静脉给药对脑缺血再灌注较长时间内NKCC1的影响如何，目前未见报导。因此，本研究拟通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型，静脉预先单次给予布美他尼，观察布美他尼对大鼠脑水肿、脑梗死体积、神经功能缺陷评分和NKCC1表达的影响，为临床研究与应用提供理论依据。方法雄性SD大鼠135只，体重250～300g。随机分为三组，分别为假手术组（S组，n=27）、缺血再灌注组（I/R组，n=54）、布美他尼处理组（B+I/R组，n=54）。除S组外，参照Longa线栓法，均采用大脑中动脉栓塞2h，再灌注3h、24h、48h的方法建立局灶性脑缺血再灌注模型。B+I/R组和I/R组于栓塞前10min分别经尾静脉注射布美他尼（30mg/kg）和等容量盐水。再灌注3h、24h、48h行神经功能缺陷评分（NDS），然后取脑组织，干湿重法测定脑水肿率，TTC染色法测定脑梗死体积，免疫组化法观察NKCC1的表达。结果1.神经功能缺陷评分S组未见神经功能缺陷。组内比较，I/R组再灌注3h、24h、48h的NDS评分比较差异无统计学意义（P0.05）；B+I/R组再灌注24h、48h的NDS评分低于再灌注3h（P0.05）。组间比较，B+I/R组再灌注24h、48h的NDS评分低于I/R组（P0.05）。2.脑水肿率S组大鼠无明显脑水肿表现。与S组比较，I/R组缺血侧脑水肿明显，在再灌注3h、24h、48h脑水肿率均升高（P0.05）；B+IR组在再灌注24h、48h脑水肿率升高（P0.05）。与I/R组比较，再灌注24h、48hB+I/R组脑水肿率减轻（P0.05）。3.脑梗死体积S组未发现脑梗死。在再灌注3h、24h、48hI/R组与B+I/R组均出现不同程度的脑梗死；在再灌注3h，B+I/R组脑梗死体积少于I/R组（P0.05）；在再灌注24h、48h，两组脑梗死体积差异无统计学意义（P0.05）。4.大鼠脑皮质NKCC1的表达NKCC1在神经元胞体膜和树突的细胞膜上均有表达。S组NKCC1表达较少，I/R组和B+I/R组大脑皮质NKCC1表达增多(P0.05