番茄mads-box转录因子slfyfl调控衰老和果实成熟的分子机理研究-molecular mechanism of tomato mads - box transcription factor slf yfl regulating senescence and fruit ripening.docx

摘要MADS-box 蛋白是一类广泛存在于真核生物中的转录因子家族。在高等植物 中 MADS-box 蛋白主要在果实成熟、脱落，器官衰老及花器官的形成等生长发育 过程中发挥作用。2002 年，通过图位克隆法，Vrebalov 等找到了 MADS-box 家族 转录因子 SlMADS-RIN，并证明其为影响番茄果实成熟的关键转录因子，且作用 于乙烯合成途径。为进一步分析番茄 MADS-box 家族中其他未知基因的功能，本 研究通过生物信息学分析，分离和克隆到一个与拟南芥 MADS-box 蛋白 AtFYF（AtAGL42）直系同源且与 SlMADS-RIN 蛋白相似度较高的番茄 SlFYF-Like (SlMBP18)蛋白，并登录到了 NCBI 数据库（GenBank 登录号：KF709444）。利用实时荧光定量 PCR 对 SlFYFL 基因的表达模式分析发现，SlFYFL 基因在 番茄叶片，果实，果柄离区和萼片中大量表达，表明该基因可能与叶片发育，果 实成熟及脱落等生长发育关系密切。为进一步探索和分析该基因的生理学功能及 其作用机理，我们分别构建了 SlFYFL 基因的超表达和 RNAi 沉默载体，通过农杆 菌介导法将其分别成功转入野生型番茄中，并培育出 SlFYFL 超表达及沉默的转基 因番茄株系。对 SlFYFL 超表达及沉默转基因番茄株系的研究结果表明：1. SlFYFL 基因可 能通过参与调控乙烯相关基因的表达而调节番茄叶片叶绿素的含量来调控番茄叶 片的衰老程度。超表达 SlFYFL 基因的番茄叶片衰老推迟，叶绿素含量升高，光合 作用相关基因（Slcab7 和 SlrbcS）表达明显上调，乙烯合成相关基因（ACO1、ACO3、 ACS1A、ACS2 和 ACS6）表达显著降低，而沉默转基因番茄叶片则表现出与超表 达转基因番茄叶片相反的表型；2. SlFYFL 基因可能通过参与调控乙烯相关基因的 表达而调节番茄果实的成熟。超表达 SlFYFL 基因的转基因番茄果实成熟时间推迟， 类胡萝卜素积累量降低，贮藏时间变长，果实硬度增加，乙烯合成量降低，而沉 默转基因株系果实的系列指标与超表达转基因株系果实相反。果实成熟相关基因， 类胡萝卜素合成基因（SlPSY1，SlPDS 及 SlZDS），细胞壁代谢基因（SlPG、SlEXP1、 SlXTH5 及 SlTBG4）和脂肪酸代谢基因（SlTomLoxA，SlTomLoxB 及 SlTomLoxC） 的表达在超表达转基因果实中受到明显抑制，而在沉默转基因果实中显著上调； 乙烯合成相关基因（RIN、ACS2、ACO1 及 ACO3）及乙烯响应基因（E4 和 E8） 在沉默转基因果实中显著上调，而在超表达转基因果实中受到明显抑制。果实硬 度测定结果表明，超表达转基因果实的硬度明显大于野生型同时期的果实而沉默转 基因果实的硬度较野生型的明显降低。耐贮藏实验发现，超表达转基因果实的贮 藏时间明显长于野生型番茄，而沉默转基因番茄的贮藏时间比野生型显著缩短。 果实乙烯含量测定显示，超表达转基因果实的乙烯合成量仅为野生型的 40%-50%，I而沉默转基因果实的乙烯合成量比野生型果实高 3.5 倍以上，表明 SlFYFL 可能在乙烯上游发挥作用而调控番茄果实的成熟；3. SlFYFL 参与了乙烯相关的离区发育 过程。表型观察发现，超表达 SlFYFL 基因的转基因番茄果实脱落推迟，而沉默转 基因番茄果实脱落提前。显微镜观察结果显示，果柄离区中离层细胞的形成在超 表达转基因番茄果柄离区中的发育推迟而在沉默转基因番茄果柄离区中显著提 前。断裂力度测试发现，拉断超表达转基因果柄离区所需断裂力度相比野生型增 大，拉断沉默转基因果柄离区所需断裂力度相比野生型减小。实时荧光定量 PCR 结果发现，离区发育相关基因（SlMADS-MC、JOINTLESS、Bl、WUS、Ls 及 GOB） 的表达在超表达转基因株系的果柄离区中明显下调，而在沉默转基因株系的果柄 离区中显著上调；乙烯合成相关基因（ACS4、ACS2、ACS1A、ACO1 及 ACO3） 的表达在超表达转基因株系的果柄离区中显著下调而在沉默转基因株系的果柄离 区中明显提高，说明 SlFYFL 基因可能通过乙烯来调控离区发育相关基因的表达进 而调节果柄离区的发育。由于 MADS-box 蛋白通常形成同源或异源二聚体发挥调控作用。因此，本研 究进一步探索了番茄中相关 MADS-box 蛋白的相互作用。酵母双杂交结果发现， SlFYFL 可与其自身，番茄果实成熟相关的 SlMADS-RIN、SlMADS1 蛋白之间分别 发生相互作用，说明 SlFYFL 可能通过与 SlMADS-RIN 和 SlMADS1 相互作用而影 响乙烯进而调控番茄的果实成熟。