非受体酪氨酸激酶c-abl调节微管组装的机理分析-mechanism analysis of non-receptor tyrosine kinase c - abl regulating microtubule assembly.docxVIP

非受体酪氨酸激酶 c-Abl 调节微管组装的机理研究摘要非受体型酪氨酸激酶 c-Abl 是 Abelson 鼠白血病病毒 v-abl 原癌基因在哺乳动 物细胞内的同源基因，在哺乳动物中广泛表达。c-Abl 蛋白具有丰富的结构域，其 中 SH3 结构域能特异地识别富含脯氨酸残基的蛋白区域，SH2 结构域能特异地识 别可被磷酸化的酪氨酸序列。通过 NLS 和 NES 结构在细胞核和细胞质之间进行穿 梭，使之定位于不同的亚细胞结构。绝大多数胞质 c-Abl 通过其 C 端与 G/F-肌动 蛋白细胞骨架相连，从而调节 F-肌动蛋白依赖的细胞骨架的变化。c-Abl 在正常生 理及病理条件下具有多种生物学功能，参与细胞周期调控、细胞黏附迁移和细胞 凋亡调控，并在氧化应激和 DNA 损伤修复过程中发挥重要的作用。微管是一种细胞骨架结构，主要由微管蛋白 α/β 二聚体组成，具有支持细胞结 构、固定细胞器位置的作用，并参与构成纤毛与鞭毛、神经细胞轴突，另外还是 中心体和纺锤体的重要组成部分。纺锤体在有丝分裂过程发挥着极其重要的作用， 在有丝分裂期牵引染色体的移动并介导姐妹染色体的分离，在有丝分裂末期引导 收缩环的形成从而促进胞质分裂。PLK1 和 FOXM1 是两个与细胞周期有关的蛋白，它们都呈现细胞周期依赖性 表达。FOXM1 是一类 DNA 结合区具有翼状螺旋结构的转录因子，属 FOX 蛋白家 族，主要参与细胞周期特异性基因的调节，促进细胞增殖，它的表达和活性受许 多增殖信号和抗增殖信号的调节。PLK1 属于 Polo 样激酶家族，是一类广泛存在 于真核细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞周期调节、细胞增殖、肿瘤发生等方 面有重要作用。它们都参与中心体和纺锤体的形成。FOXM1 是 PLK1 激酶的底物， FOXM1 也可以调节 PLK1 的表达，二者通过相互作用调节一系列细胞周期蛋白和 因子，共同影响细胞周期。本研究通过免疫沉淀和免疫印迹证实，c-Abl 可以与 PLK1 相互作用，并磷酸 化 PLK1，因此 PLK1 是 c-Abl 激酶的底物。还通过细胞周期同步化的方法发现它们之间的相互作用以及 c-Abl 对 PLK1 的磷酸化都是随细胞周期进程的变化而变化的。还通过荧光定量 PCR 和报告基因检测技术证实 c-Abl 可以促进 FOXM1 的转 录；通过脉冲追踪实验证实 c-Abl 可以抑制 FOXM1 的降解；通过免疫印迹的方法 证明 c-Abl 可提高 FOXM1 的蛋白水平，且这种作用依赖于 c-Abl 的激酶活性。因 此 c-Abl 激酶通过与其底物 PLK1 相互作用并调节其磷酸化而间接影响了 FOXM1 的表达和蛋白稳定性。本研究中分离了聚合和溶解状态的微管蛋白，通过免疫印迹的方法检测了它 们的蛋白水平，发现 c-Abl 敲低后溶解状态的微管所占比例升高，而聚合状态所占 微管的比例下降；又通过非变性 PAGE 胶分离了生理状态的微管，发现 c-Abl 敲低 后微管的聚合程度明显下降，这说明 c-Abl 能够抑制微管的解聚。还通过免疫荧光 技术发现 c-Abl 敲低后细胞的微管结构变得模糊和弥散，说明 c-Abl 缺陷影响了微 管的组装。另外我们还用免疫印迹的方法比较了 c-Abl 敲低细胞中微管蛋白的水 平，发现与野生型细胞相比，c-Abl 敲低后微管蛋白的量明显下降，这说明 c-Abl 可抑制微管蛋白的降解。c-Abl 对微管聚合和组装的影响势必影响纺锤体的组装。我们通过免疫荧光技 术对有丝分裂期纺锤体进行了免疫荧光染色，发现 c-Abl 敲低后纺锤体的组装出现 缺陷。还发现非分裂期的 c-Abl 敲低细胞系中有许多多核细胞出现，这说明 c-Abl 缺陷影响了胞质分裂的正常进行。本研究发现了一个新的 c-Abl 底物 PLK1，并初步证实 c-Abl 通过与 PLK1 相 互作用和对 PLK1 进行磷酸化，进而通过多个途径对细胞周期进行调节。c-Abl 通 过调节转录因子 FOXM1 的表达和活性，从而调节 G2/M 期特异性基因的转录；通 过调节与纺锤体组装有关的 PLK1 底物对有丝分裂期进行调控；通过调节与胞质分 裂有关的 PLK1 底物对胞质分裂进行调控。鉴于微管组装在细胞有丝分裂中的重要 作用，本研究为深入认识 Abl 家族酪氨酸激酶在细胞周期调控中的作用提供了新 的依据。关键词：非受体酪氨酸激酶；微管；PLK1；FOXM1The Assembly of Microtubule is Regulated by Non-receptor Tyrosine Kinase c-AblAbstractThe non-receptor tyrosine kinase c-Abl in mammalian whose h