肥胖差异性蛋白14-3-3γ的验证及其机制分析-verification and mechanism analysis of obesity differential protein 14 - 3 - 3γ.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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肥胖差异性蛋白14-3-3γ的验证及其机制分析-verification and mechanism analysis of obesity differential protein 14 - 3 - 3γ.docx

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肥胖差异性蛋白14-3-3γ的验证及其机制分析-verification and mechanism analysis of obesity differential protein 14 - 3 - 3γ

摘要研究目的：核实通过利用蛋白组学技术筛选出差异性最显著蛋白 Pin 1 及 14-3-3γ 的准确性，研究 Pin 1 及 14-3-3γ 在肥胖发病机制中发挥的作用。研究方法：1.体内实验：50 只 4 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠，随机分组分为高脂组和低脂组，分别给予高脂及低脂饮食 14 周，于 0 周、4 周、14 周留取小鼠附睾周围白色脂肪组织标本，在 mRNA 及蛋白水平验证 Pin 1 及 14-3-3γ 的表达是否与蛋白组学筛选的结果一致。2.选择其中一个蛋白，即 14-3-3γ，进行体外实验：3T3-L1 脂肪细胞培养，分别于 d 0、d 2、d 4、d 8、d 10、d 12 天留取细胞标本，在 mRNA 及蛋白水平观察 14-3-3γ 在脂肪细胞生长发育过程当中的表达变化。3.体外实验：①siRNA 介导 3T3-L1 脂肪细胞 14-3-3γ 的基因沉默：同上的 3T3-L1 细胞培养诱导分化为成熟脂肪细胞，外源性 siRNA 片段及作为阴性对照的 mock 片段由上海吉凯生物技术公司代为合成，d -2 天进行外源性 siRNA 片段转染，mock 为对照。②基因沉默 14-3-3γ 后脂肪细胞形态学的改变：基因沉默 14-3-3γ 在 3T3-L1 脂肪细胞中的表达后，mork 为对照，d 8 天对脂肪细胞进行油红染色，显微镜下观察脂肪细胞形态学的改变。③影响脂肪细胞分化的机制研究：基因沉默14-3-3γ 后，分析对脂肪细胞生长发育过程中重要的调节因子 PPARγ 及C/EBPα 在 d 8 天及 d 6 天在 mRNA 水平的表达的改变。研究结果：1.在 4 周时，相对于低脂组，高脂组小鼠附睾周围脂肪组织中 Pin 1 的表达水平降低，且有统计学意义（P0.05）；高脂组小鼠附睾周围脂肪组织中 14-3-3γ 的表达水平升高，且有统计学意义（P0.05）；这与蛋白组学筛选的结果一致。‐ 1 ‐2.在脂肪细胞生长发育过程当中，14-3-3γ 从 d 0 天到 d 8 天表达水平逐渐升高，d 8 时达到高峰，随后表达水平逐渐降低。这提示 14-3-3γ与脂肪细胞的分化密切相关。3.siRNA 介导 3T3-L1 脂肪细胞 14-3-3γ 的基因沉默，mork 为阴性对照，d 8 天对脂肪细胞进行油红染色，显微镜下观察脂肪细胞形态学的改变，发现沉默后的 3T3-L1 脂肪细胞同一视野下与对照相比脂滴数目变少，体积变小。这提示 14-3-3γ 基因沉默后的脂肪细胞分化受到抑制。4.与 mock 相比，14-3-3γ 基因沉默后的脂肪细胞中，调节因子 PPARγ 及 C/EBPα 在 d 8 天及 d 6 天 mRNA 水平的表达降低。这提示 14-3-3γ 可能通过抑制 PPARγ 及 C/EBPα 表达来抑制脂肪细胞分化。结论：Pin 1 及 14-3-3γ 在肥胖发病机制中发挥的作用，现阶段我们的研究发现 14-3-3γ 可能作用于调节因子 PPARγ 及 C/EBPα 来调节脂肪细胞的由前脂肪细胞向成熟脂肪细胞发育。希望为临床治疗肥胖提供新的靶点。关键词：Pin 1，14-3-3γ，脂肪组织，脂肪细胞分化，肥胖AbstractObjective: The aim of the present study was to uncover proteins -Pin1 and 14-3-3γ- differentially expressed in the WAT and study the role of the identified proteins in adipocyte differentiation.Methods and materials:In vivo: ①Mouse model: 50 4-week-old male C57BL/6J mice were fed adaptability 7 days, and then were randomization into high fat diet group and low fat diet group, each group has 25 mice. The week after grouped was recorded as 0 week. The mice in the two groups were fed with high fat diet and low fat diet respectively for 14 weeks respectively. Whiteadipose tissue was collected at 0, 4th and 14th week.② Quant