金属螯合亲和色谱填料的制备及其在六聚组氨酸融合蛋白分离中的运用.pdfVIP

金属螯合亲和色谱填料的制备及其在六聚组氨酸 融合蛋白分离中的应用 孙永亮 摘要近年来，随着基因工程技术的发展，分离纯化基因重组蛋白的下游技 术越来越显示出其重要性。从成分复杂的表达体系中分离纯化目的蛋白是一项艰 巨而繁重的任务。目前基于分子的尺寸、形状、电荷、分子量、吸附等性质的差 异进行蛋白质分离的方法也已在蛋白质纯化中得到不同程度的应用，而金属螯合 亲和层析法(Metal ChelateAffinity Metalion 和层析法Immobilized Affinity 选择性好、操作简单丽成为一种重要的蛋白质分离方法。研究表明，影响金属螯 合亲和色谱分离效果的因素很多，如溶液的pH值、盐浓度、洗脱方式等，但决定 色谱填料分离效果的主要因素在于填料的基质、配基及螯合金属离子种类。琼脂 糖(Agarose)具有良好的亲水性和稳定性，与可溶性蛋白的非特异性反应小。作 为填料基质既可在非变性条件下使用，又可在变性条件(如6mol／L笳酸胍或8 molFL尿素)下使用。本实验用琼脂糖作为基质，选用四配位，与金属离子有较强 作用力的羧甲基天冬氨酸为配基，以C02+、Ni”作为螫合会属离子，合成了一系列 会属蟹合亲和色谱填料，并对其蛋白质分离性能进行了研究。论文主要工作为以 下几个方面： 结果显示：介质表面光滑，说明在实验过程中没有引起微球形貌的变化，即在实 验过程中没有产生能引起非特异性吸附的因素。用这两种介质对六聚组氨酸融合 蛋白进行了分离，对目标蛋白的沈脱液做了SDS—PAGE分析，结果表明：两者都 取得了良好的分离效果，并且Agarose．CM．Asp—co分离效果最佳。 2．以琼脂糖为基质，环氧氯丙烷为交联剂，制备了一系列不同羧甲基天冬氨 10～、3．83×10～、 对其进行了滴定分析，测得各自的配基数日依次分别为：3，34x 合量已基本饱和。对上述三种不同CM．Asp担载量所制备螯合金属离子样品进行 湿法硝解，通过原子吸收测定金属离子担载量，其结果也支持了上述观点。用上 氨酸融合蛋白分离，结果显示，金属离子螯合量的变化只影响到色谱介质的蛋白 质吸附量，而对分离纯度没有明显影响。 3．优化了对200 司产品)两种螫合介质对融合蛋白的纯化效果。结果表明：针对200儿L细胞裂解液 孵育时间为30min，洗脱时最佳咪哗浓度为200 介质相比，清洗条件简单，介质选择性好，洗脱得到的靶蛋白纯度高。且本研究 Ni-NTA—Agarose。 关键词： 标记蛋白纯化 ofMetalChelate Preparation Affinity Mediumand inPurificationof Application Proteins Histidine-tagged Sun Yongliang In for Abstractrecent the of years，withdevelopmenttechniquesgenetic in recombination moreand techniquesseparation become engineefing，the proteins more isahardand tasktoisola