动物细胞培养常见问题PPT.pptxVIP

细胞培养 ？ 常见问题解析 你有这些装备么？？ 要对细胞有感情？？ 还是对细胞有原则！ 复 苏 传 代 保 种 前 期 准 备 TIME TABLE DAY 0~1 前期准备 DAY 2 复苏细胞 DAY 3 细胞换液 DAY 4~6 细胞培养 DAY 7 细胞传代 DAY 8…… 器材灭菌、 选定细胞 DAY 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 …… 将细胞从-80转至37度培养 细胞换 培养液 细胞进入指数增长期，细胞分裂，数量指数增加 细胞分盘， 降低细胞密度 细胞培养 进行后续实验…… 培养液冲悬沉淀细胞 调整细胞浓度培养 复 苏 实验室消毒材料准备 冻存管中冻存液快速融化 加培养液离心弃上清 量的多少主要取决于DMSO的浓度，若培养基太少，DMSO的浓度就比较大，会影响细胞生长。一般DMSO的浓度小于0.5%为无害浓度。 一般情况8ml培养基/1~2ml冻存液。 目的：去除DMSO，去除死细胞。但一般情况下，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大会死亡。 一般情况1000~1500rmp，3~5分钟 复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。 细胞复苏中的常见问题 冻存液 在常温下，二甲基亚砜（DMSO）对细胞的毒副作较大，因此必须在1-2min内使冻存液完全融化， 即从-80度冰箱或液氮中取出后立即置于37度水浴锅中解冻。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤。 细胞 贴壁少 一般冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10-15ml 培养液，但培养基越少细胞越容易贴附。 培养基 的量 复 苏 S 1 一般复苏之后第二天给细胞换液，即将平皿中培养液吸干净，加入新鲜培养液10ml左右~ 目的：稀释DMSO，去除死细胞，漂浮物等。 S 2 细胞培养 细胞在平皿上贴壁， 利用培养基的营养进行代谢、分裂。 细胞数量呈指数型增长。 将细胞置于37度恒温CO2培养箱（孵箱）中放置2~3天，每天镜下观察细胞状态很必要。 S 3 细胞分盘 细胞浓度过大不利于细胞的生长，所以要定期分盘，即将一个平皿内的细胞收集起来分到3个平皿内培养，降低细胞浓度。 将平皿中培养基吸干净，加入1~2ml胰酶消化，收集细胞至BD管中，离心分离，倒掉上清液，培养液冲悬细胞，分别加至3个含有10ml左右培养液的平皿中。放入孵箱培养 传 代 传代过程中的常见问题-1 1、CO2张力不对 2、培养瓶盖拧得太紧 3、NaHCO3缓冲系统缓冲力不足 4、培养液中盐浓度不正确 培养液PH值变化太快 可能原因： 建议解决办法： 1、按培养液中 NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内 CO2 浓度，2.0g/L 到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓 度为5％ 到10％。 改用不依赖CO2 培养液。 2、松开瓶盖1/4圈 3、加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 4、在CO2培养环境中改用基于 Earle′s 盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用 Hanks 盐配制的培养液。 传 代 用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌 将培养液加热到37℃，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，说明培养液污染，丢弃培养液 丢弃培养物。 或用抗生素除菌。 缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现 支原体污染，丢弃培养物。 培养液出现沉淀， 但 pH值不变 用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来 冰冻保存培养液 培养液出现沉淀， 同时pH发生变化 细菌或真菌污染 培养细胞 不贴壁 胰蛋白酶消化过度 支原体污染 培养液中无贴壁因子 传代过程中的常见问题-2 传 代 代谢产物积累过多 细胞状态 不好 换液，换胎牛培养液 传代次数过多 细胞基本不能用了 细胞出现漂浮物