第6章 蛋白质的分子结构.ppt

第三节：蛋白质的分子结构 一、蛋白质的一级结构 二、蛋白质的二级结构和纤维状蛋白 三、蛋白质的三级结构 四、蛋白质的四级结构 蛋白质的结构 蛋白质是由一条或多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大。 一、蛋白质的一级结构 1. 定义—— 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定：蛋白质的一级结构指蛋白质多肽连中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。 2.蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 （1）测定蛋白质一级结构的要求 a、样品必需纯（97%以上）； b、知道蛋白质的分子量； c、知道蛋白质由几个亚基组成； (2) 测定步骤 A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 （2）测定步骤 B.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 ( 2) 测定步骤 B.多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍或高浓度盐处理，即可分开多肽链(亚基)。 (2) 测定步骤 C.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（如，ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 (2) 测定步骤 可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。 巯基（-SH）的保护 (2) 测定步骤 D.分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-多肽或DNP-蛋白质）。 DNP-多肽在酸性条件下水解，只有N-末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍生物，其余的都是游离氨基酸。只要鉴别所生成的DNP-氨基酸，就可得知N-末端氨基酸。该产物能够用有机溶剂（如乙醚、乙酸乙酯）抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯，DNS）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol，比DNFB法高100倍。DNS-氨基酸不需要抽提，可直接用纸电泳或者薄层层析加以鉴定。 多肽或蛋白质的末端氨基也和氨基酸的α-氨基一样能与PITC（Edman试剂）作用，生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质，简称PTC-多肽或PTC-蛋白质。后者在酸性有机溶剂中加热时，N一末端的PTC一氨基酸发生环化，生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来，除去N-末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的，因为PTC基的引入只使第一个肽键的稳定性降低。反应液中代表N-末端残基的PTH-氨基酸，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层折、气相色谱和HPLC等进行鉴定。此方法还可以用来测定氨基酸序列。 氨肽酶法 氨肽酶是一类肽链外切酶或叫外肽酶，它们能从多肽 链的N－末端逐个地向里切。根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该蛋白质的N-末端残基序列。实际上此法用于测定N一末端和末端残基序列有许多围难，困为酶对各种肽键敏感性不一样，常常难以判断哪个残基在前，哪个残基在后。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶（LAP），亮氨酸氨肽酶不是只能水解以Leu为N-末端残基的肽键，只是水解以Leu为N-末端的肽键速度为最大。 在蛋白质或多肽的氨基酸序列测定中，经常会碰到N－末端残基的氨基被封闭。因此下能与Edman降解试剂（PITC）发生作用。N-末端残基受封闭的种类很多例如焦谷氨酰环化、乙酰化以及某些环状肽（如短杆菌肽S）N一末端和C一末端连接成环等。如果遇上肽链