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第四章 沉淀分离法 生物分离过程的一般流程 定义——利用某种沉淀剂使目标产物或杂质的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程 目的—— 浓缩； 有选择地沉淀杂质或所需成分，初步纯化； 将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。 A、设备简、成本低、易放大 B、原料液体积减小10~50倍，简化工艺、降低生产费用； C、使中间产物保持在一个中性温和的环境； D、及早将目标蛋白质从其蛋白水解酶分离出来，避免pr降 解，提高产物稳定性； E、作为蛋白质色谱分离前处理，可使使用色谱分离的限制 因素降低到最少。 缺点： A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂，所以沉淀法产品纯度通常都比结晶法低； B、针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强 C、纯化倍数低 蛋白质溶解：相似相溶 aa的亲水性和疏水性： 有利因素：亲水性，包括氢键、极性基团、离子化侧链、亲水aa所占的%等。如白蛋白 不利因素：疏水性，包括暴露的疏水基团、疏水aa所占的%等。如纤维蛋白原。 4.1.2.2 蛋白质溶液的稳定因素 ⑴蛋白质周围的水化层，保护蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 ⑵蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用。（存在双电层）蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。由于静电力的作用，分子间相互排斥，形成稳定的分散系。 生物分子在水中形成稳定溶液是有条件的，任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。 沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液的各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的， 溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。 4.1.4沉淀生成动力学 溶解度值的降低是一个动力学过程。当体系变得不稳定以后，分子互相碰撞并产生聚并作用。通常认为相互碰撞由下面几种运动引起： ①热运动，Bromnian运动； ②对流运动，由机械搅拌产生； ③差示沉降，由颗粒自由沉降速度不同造成的。 沉淀生成动力学 为了简化沉淀过程动力学， 可把沉淀过程分成下述６个步骤： (1) 初始混合 (2) 新相生成 (3) 布朗运动凝集 (4) 机械碰撞凝集 (5) 聚集体陈化 (6) 聚集体沉淀 沉淀法操作步骤按三步进行： ①首先加入沉淀剂， ②沉淀剂的陈化，促进粒子生长； ③离心或过滤，收集沉淀物。 加沉淀剂的方式和陈化条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。 4.1.5 沉淀分离的类型 盐析沉淀法 有机溶剂沉淀法 等电点沉淀法 高分子聚合物沉淀法 其它沉淀法 4.2 盐析法 盐溶：在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加。 盐溶的作用机理：蛋白质表面电荷吸附某种盐离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白质分子与水分子间的相互作用却加强，因而使溶解度提高. 盐析：在高浓度中性盐存在下，使目标产物的溶解度降低而产生沉淀的过程 4.2.2 盐析作用机理 破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。 离子强度对盐析过程的影响 Cohn经验公式 S—蛋白质溶解度，mol/L; I—离子强度 c:离子浓度；Z：离子化合价 Cohn经验式蛋白质溶解度与盐浓度的关系 ㏒ S=β-ＫsＩ S—蛋白质的溶解度，g/L; I－离子强度， β—常数，图中截距 Ks—盐析常数，图中直线斜率 β—β代表截距，即当离子强度为零，也就是纯水中的假想溶解度的对数。与蛋白质种类、温度、pH值有关，与盐无关； Ks—盐析常数，代表图中直线的斜率； 实验结果表明，Ks与温度和pH无关，但和蛋白质与盐的种类有关。变化不是很大，例如以硫酸铵作为沉淀剂时，Ks值对不同的蛋白质来说，其变化不会超过1倍。 用盐析法分离蛋白质的二种方法 盐析法分为两类， 第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液； 第二种叫β分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶。 4.2.3.1 蛋