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丹参SmNAC1基因克隆和生物信息学分析 　　[摘要] 为了研究丹参中特有的NAC转录子在丹参生长发育、激素调节和抗逆胁迫应答调节中的功能，对丹参NAC转录因子进行了克隆和分析。根据丹参毛状根cDNA文库中筛选到的NAC EST序列，克隆了丹参SmNAC1的cDNA全长序列。生物信息学分析显示基因的开放阅读框591 bp，编码166个氨基酸，相对分子质量21.66 kDa，等电点4.36 Genbank kF006346。SmNAC1蛋白的N-端具有保守的NAC_AB结构域，C-端高度变异。根据软件预测SmNAC1可能定位在细胞核。qRT-PCR分析YE+Ag+处理后SmNAC1在丹参毛状根中的表达变化，处理后2 h表达量上调至对照的1.5倍，4～12 h保持2倍的表达量，36 h时下降至对照水平以下，推测SmNAC1可能参与了丹参毛状根对YE+Ag+的胁迫应答调节。 　　[关键词] 丹参；NAC转录因子；SmBF3-2；分子克隆；生物信息学 　　NAC转录因子是植物中最大的转录因子家族，在植物的生长调节以及逆境应答分子网络中扮演着极其重要的角色，目前为止已经从拟南芥中鉴定出117个NAC转录因子基因[1-2]，水稻中151个[3]，葡萄中143个[4]，毛果杨中163个[5]，烟草[6]和大豆[7]中各有152个。NAC家族转录因子N-端有一个高度保守的NAC结构域，可进一步分为A-E5个保守的子域，具有DNA结合（DNA Binding）或蛋白质和二聚体结合功能。与N-端的保守不同，NAC的C端无论是在氨基酸序列还是长度方面都具有高度的多样性，具有转录激活、抑制或者与蛋白质结合活性[8]。实验证明不同物种的高同源性NAC基因可能执行不同的功能。NAC基因参与介导胁迫对植物生长发育的影响，这往往是生物胁迫间、非生物胁迫间以及生物与非生物胁迫间信号调控通路的关键节点[9]。目前关于NAC的研究较少，且多集中于拟南芥、水稻等模式植物。在丹参中仅克隆到1条NAC转录因子SmBTF[10]。本研究组从丹参毛状根cDNA文库中得到1条NAC转录因子的EST序列，在此基础上克隆得到了SmNAC1基因的全长cDNA序列，并通过生物信息学分析其编码的蛋白质理化性质、保守功能域等生物学信息，为进一步研究丹参中该类转录因子提供信息和依据。 　　1 材料 　　用丹参叶片经农杆菌ACCC10060介导产生的不定根[11-12]，用6，7-V培养基继代， 恒温26℃，80 r·min-1摇床暗培养培养18 d，用??浓度30 mmol·L-1Ag+和100 g·L-1酵母提取物联合处理， 0，2，4，8，12，24 h取样，液氮速冻，-80 ℃保存。 　　2 方法 　　2.1 RNA提取与反转录 采用Trizol法提取丹参毛状根总RNA。取0.1 g毛状根，加入0.2 mg聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP），在液氮中研磨粉碎，加入1 mL Trizol（Ambion公司）室温放置10 min充分裂解，4 ℃ 12 000 r·min-1离心取上清，依次用氯仿和异丙醇洗脱，75%乙醇-20 ℃沉淀2 h，最后用20 μL去除RNA酶的水溶解。用NANO Drop核酸定量仪测定RNA浓度，取1.0 μg RNA，应用Thermo反转录试剂盒，按照附带的操作流程利用Oligo（dT）18引物反转录成总cDNA。 　　2.2 SmNAC1cDNA全长克隆 根据得到的SmNAC1基因片段设计PCR特异性引物SmNAC1-F：5′-ATGACTCAATCCCAGGAGGAG-3′，SmNAC1-R：5′-CTAGTTTGTGAGCTCCATAATGG-3′，以丹参毛状根总cDNA为模板进行PCR扩增。扩增体系为ddH2O 15.4 μL，dNTP 1.6 μL，Ex Taq Buffer 2.0 μL，引物（10 nmol·L-1）各0.4 μL，Ex Taq（5 U·L-1）0.1 μL。扩增条件为95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min， 30个循环，72 ℃延伸10 min。1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。用Thermo Gene JET PCR纯化试剂盒纯化PCR产物后连接pGEM-T easy载体，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性单克隆送北京华大基因研究中心测序。 　　2.3 SmNAC1生物信息学分析 将全长cDNA序列在NCBI数据库的 ORF Finder（http：///gorf/orfig.cgi）中分析SmNAC1序列的ORF，推导编码氨基酸的基因序列。应用BLAST程序（http：//）检索相似蛋白，用Clustal W（htt