丹参转录因子SmWRKY1蛋白表达和纯化条件优化研究.docVIP

丹参转录因子SmWRKY1蛋白表达和纯化条件优化研究 　　[摘要] WRKY转录因子是一类含有高度保守的WRKY结构域的锌指蛋白，是植物所特有的转录因子家族。该研究将已克隆的SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21 （DE3） 进行诱导表达，SDS结果显示该蛋白的大小约36 kDa，与预测的蛋白相对分子质量一样，说明该基因在大肠杆菌中成功表达。对影响蛋白表达的4个因素：诱导时间、诱导温度、IPTG浓度及诱导前菌液的浓度进行优化，结果表明在大肠杆菌BL21 （DE3） 中，当A600达到约1.0～1.5时，加入0.2 mol·L-1的IPTG，在20 ℃诱导培养12 h后SmWRKY1蛋白的表达量较高。原核表达产物SmWRKY1蛋白以包涵体的形式存在，采用尿素提取包涵体蛋白，用Ni2+亲和色谱法纯化表达蛋白，纯化后蛋白的质量浓度为2.454 g·L-1。经蛋白质印迹检测，His-Tag单克隆抗体可以特异性的识别SmWRKY1蛋白，进一步证实丹参SmWRKY1蛋白在大肠杆菌中成功表达。本研究为进一步开展SmWRKY1基因的表达与丹参酮类等化合物的生物合成相关研究奠定了工作基础。 　　[关键词] 丹参；SmWRKY1；优化表达；包涵体蛋白；蛋白质印迹 　　WRKY转录因子作为植物中最庞大的转录因子家族之一，在植物的生长发育过程中起到非常重要的作用，除参与植物对生物和非生物环境胁迫的调控作用，还参与了次生代谢产物的生物合成的调节作用。据报道该转录因子可以与目的靶基因启动子区域的W-BOX顺式元件（C/T）TGAC（T/C）特异性结合[1-2]，从而激活相关基因的表达，实现其在转录水平上的调控作用。Xu和Wang等从亚洲木本棉花中分离得到GaWRKY1，能激活植物抗毒素棉籽酚生物合成过程中关键酶CAD1基因的表达，进一步促进棉籽酚的生物合成[3]。Kato和Dubouzet等发现日本黄连中WRKY1蛋白能够调节黄连生物合成途径中下游基因的表达，促进日本黄连生物碱的生物合成[4]。由此可见WRKY转录因子在转录水平上对次生代谢产物生物合成途径中的关键酶起着非常重要的调节作用。 　　本研究将已克隆的SmWRKY1 cDNA构建到原核表达载体pET28a上，转化大肠杆菌BL21 （DE3） 进行诱导表达，并对其诱导条件进一步优化，采用尿素提取包涵体蛋白，利用His-Tag亲和色谱对该蛋白进行纯化，Western印迹进一步验证SmWRKY1在大肠杆菌中表达。丹参SmWRKY1基因在大肠杆菌中的成功表达及纯化，为研究该基因对丹参酮类等化合物的生物合成的调节控制奠定了一定的基础。 　　1材料 　　1.1菌株、质粒、培养基 　　转化菌株Escherichia coli DH5α和表达宿主细胞BL21 （DE3） 购自北京全式金生物技术有限公司，表达载体pET28a为本实验室所保存。E. coli [pET28a-SmWRKY1] 是转化了pET28a-SmWRKY1的大肠杆菌；仅转化pET28a质粒的大肠杆菌E. coli [pET28a]为阴性对照重组菌。 　　LB培养基（胰蛋白胨10 g·L-1， 酵母提取物 5 g·L-1， NaCl 10 g·L-1， pH 7.0；固体培养基加琼脂糖15 g·L-1）用来培养大肠杆菌。 　　1.2抗生素 　　卡那霉素购自Sigma公司，配置质量浓度为50 g·L-1。 　　1.3酶和试剂 　　限制性核酸内切酶购自NEB公司；IPTG购自Sigma公司；原核表达所用的非预染蛋白Marker 购自Fermentas公司；Ni2+ SepharoseTM 6 Fast Flow购自GE公司；预染Marker购自NEB公司，His-Tag单克隆抗体，HRP-羊抗小鼠二抗及ECL超敏发光液购自华兴博创公司。其他试剂均为分析纯。 　　1.4SDS-聚丙烯凝胶电泳 　　配制SDS凝胶（15%的分离胶和5%的浓缩胶），使用BIO-RAD公司的Mini-PROTEAN Tetra电泳槽进行重组蛋白的分析[5]。 　　2方法 　　2.1SmWRKY1原核表达载体的构建和鉴定 　　利用限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ分别对目的基因SmWRKY1的PCR产物和原核表达载体pET28a进行双酶切，将纯化后的PCR产物与表达载体pET28a连接，重组质粒转化E. coli BL21 （DE3） 感受态细胞。涉及到的实验技术均参考文献[6-7]。用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定分析，1%的琼脂糖电泳检测插入片段的大小，并对重组质粒pET28a-WRKY1进行测序鉴定。 　　2.2SmWRKY1原核表达 　　挑取阳性重组菌的单菌落，接种于2 mL含Kan的LB液