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石油—重金属复合污染土壤微生物修复研究 　　摘要：以山东省黄河三角洲孤岛油区石油-重金属复合污染盐碱土为研究对象，通过测定土壤在不同时期的脱氢酶活性、微生物生物量碳、石油烃含量，研究了微生物在石油-重金属复合污染盐碱土修复过程中降解石油的作用。研究结果表明：微生物能促进石油烃的降解，60d后，添加降解菌的实验组和未添加降解菌的对照组石油烃平均降解率分别为45.60%和17.57%。加菌的实验组微生物活性高于对照组，15d时土壤脱氢酶活性实验组比对照组高出25.98%，微生物生物量碳实验组比对照组高出43.76%。 　　关键词：微生物；石油；复合污染 　　1 引言 　　石油号称“工业的血液”，是重要的工业原料， 同时又是燃料与能源。随着工业化的不断发展，全球石油用量不断增加，使得开采面积不断扩大。目前每年世界石油的总产量近30亿t，由于意外事故或管理不当，在开采、运输、贮藏???加工过程中，约有近800万t石油污染物进入环境，其中大部分污染物进入到土壤中[1]。土壤石油污染已经成为一个全球性的、突出的环境问题。我国目前每年有近60万t石油污染物进入环境，有近10万t石油污染土壤有待解决[2]。东北、华北、华南、华东、西北不同地理位置和气候特征的油田区土壤均受到了不同程度的石油污染，含油率最高可达到23%[3]。而大庆、辽河等油田的重污染区的土壤表层（0～20cm）的含油量更是高达30%～50%[4]。土壤石油污染问题已经成为我国可持续发展所面临的重要问题。 　　在钻井废弃物的毒性检测工作中，一些常见的具有危害性的金属几乎全部检到了踪迹，如Zn、Pb、Cu、Cd、Ni、Hg、As、Ba、Cr等。叶雅文认为，这些金属元素可能是伴随开采过程中钻井液添加剂、基础添加材料（如低品质的重晶石）进入体系的，也可能是随钻屑由地层中携带出来的。大多数重金属的致毒浓度均较低，如Cd的致毒浓度为0.2μg/L，而油田废水中Cd的平均含量可达到2.7μg/L[5]。因此，石油-重金属复合污染问题亟待解决。 　　石油污染土壤的修复方法主要有物理、化学、生物和综合修复方法，而生物修复方法费用低、对环境影响小、无二次污染、不破坏土壤环境，因此采用生物方法来修复石油污染土壤。土壤微生物修复是利用土壤中微生物的代谢作用将土壤中有害的污染物降解为无害物质的过程。土壤微生物修复技术是利用土壤中原有的土著微生物或者向土壤中投加的已经驯化好的微生物，并在原有的土壤生态环境中添加适当的营养物质，分解和转化有机污染物，加快修复污染土壤。 　　本文以山东省黄河三角洲孤岛油区石油污染土壤为研究对象，通过测定不同时期的土壤脱氢酶活性、微生物生物量碳、石油烃浓度及降解率来研究微生物在石油-重金属复合污染土壤修复过程中的作用，对石油-重金属复合污染土壤的修复，具有重要理论作用和实践意义。 　　2 材料与方法 　　2.1 材料 　　供试土壤：采自山东省东营市孤岛油区典型的石油-重金属复合污染的耕层土壤（0～20cm），经风干磨细过20目筛备用。 　　供试仪器：电子天平、紫外-可见分光光度计、干燥器、真空泵、振荡器、离心机、恒温加热消煮炉、超声波器。 　　供试试剂：实验所用试剂均为分析纯。 　　供试菌种：来自山东省科学院前期研究所筛选出的石油降解菌。 　　2.2 研究方法 　　称取0.5kg过20目筛的风干土于塑料钵中，选择2种重金属（Cd、Ni），设 Cd浓度为 0、2.5、5、10、15、20 mg/kg，设Ni 浓度为0、25、50、100、150、200mg/kg ，配置模拟污染土，每种处理设对照组和实验组，每组重复3次，在室内培养60d，重金属在土壤中的各形态分配达平衡后备用。 　　将石油烃溶解后加入土壤并充分混合，施加石油烃浓度达到2000mg/kg，实验组施加40mg/kg的石油降解菌剂，对照组不施加，混匀后装盆，共66盆，并保持土壤水分在田间持水量的60%～70%，以备测定。 　　分别测定土壤在7d、15d、30d、45d、60d的脱氢酶活性、微生物量碳、石油烃含量来研究微生物在石油-重金属复合污染土壤修复过程中的作用。 　　2.3 分析方法 　　2.3.1 脱氢酶活性的测定 　　采用TTC（氯化三苯基四氮唑）分光光度法[6]。 　　（1）绘制标准曲线。配置溶液浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL的TTC标准溶液，取8支具塞比色管，分别依次加入2mLTris-HCl缓冲溶液（pH=7.6）、2mL去离子水和0.4mL不同浓度的TTC标准溶液。然后分别加入2mL的50mg/mL的Na2S溶液，振荡摇匀。反应20min，待充分显色后，加入5mL甲苯，振荡萃取微红色的TPF，过滤后上清液于4