猪瘟病毒c株重组标记疫苗候选株免疫原性与鉴别检测-预防兽医学专业论文.docx

独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得浙江大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。猢姗签夕一◇““细学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权浙江大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)I、姗魏彦迎翩躲勿签字日期：函f岛年舌月莎日签字日期：》厂萨占月fz扫学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编：万方数据浙江大学博士学位论文目录目录摘要1Abstract．．．4第—部分文献综述．8第一章猪瘟病毒与猪瘟研究进展．8第—节猪瘟病毒研究进展．81．猪瘟病毒基因组及编码蛋白的功能．．82．影响猪瘟病毒毒力相关蛋白及其变异143．猪瘟病毒的复制周期154．猪瘟病毒的致病机制165．反向遗传系统在猪瘟病毒研究中的应用18第二节猪瘟的免疫预防211．猪瘟的流行212．猪瘟病毒的变异趋势223．猪瘟兔化弱毒疫苗234．猪瘟标记疫苗23本研究目的及意义．26第二部分研究内容27第二章猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的制备与表位鉴定271．材料与方法291．1．细胞与病毒．291．2．菌株与载体．291．3．试剂与主要仪器．291．4．CSFVE2蛋白的原核表达与纯化。301．5．CSFVE2蛋白的真核表达与纯化。301．6．融合蛋白免疫反应性分析．321．7．病毒的体外培养．331．8．间接免疫荧光(IFA)331．9．抗体中和活性检测．33I万方数据浙江大学博士学位论文目录1．10．质粒抽提341．11．E2单点突变重组质粒的构建341．12．重组表达质粒转染351．13．单克隆抗体制备361．14．单克隆抗体反应性鉴定361．15．重组病毒拯救362．结果382．1．CSFVE2蛋白不同抗原区域原核蛋白鉴定．．382．2．猪瘟病毒E2单克隆抗体的制备及反应性鉴定382．3．单克隆抗体识别抗原区的鉴定．402．4．单克隆抗体识别关键氨基酸的鉴定．432．5．单克隆抗体中和活性的检测．453．讨{念45第三章携带流行毒株E2的嵌合重组C株病毒鉴定与免疫原性471．材料与方法491．1．细胞与病毒．491．2．菌株与载体．491．3．试剂与仪器．491．4．实验动物及分组．491．5．嵌合重组病毒全长cDNA的构建．501．6．毒价测定．511．7．病毒体外生长曲线测定．511．8．荧光定量PCR测定病毒基因组拷贝数511．9．猪瘟病毒攻毒保护试验．532．结果532．1．猪瘟病毒流行毒株E2高变区1变异特征532．2．嵌合重组病毒全长cDNA的拯救与鉴定．552．3．嵌合重组病毒与单克隆抗体反应性鉴定．552．4．嵌合重组病毒体外生长特性．562．5．嵌合重组病毒免疫动物的体温变化．57万方数据浙江大学博士学位论文目录2．6．重组病毒免疫动物病毒血症检测．582．7．重组病毒免疫动物抗体生成曲线．582．8．重组病毒免疫动物中和抗体差异比较．592．9．免疫动物抵御猪瘟病毒攻毒．603．讨论61第四章Erns核心抗原区氨基酸变异对猪瘟病毒复制的影响．．631．材料与方法661．1．细胞与病毒．661．2．菌株与载体．661．3．试剂与仪器．661．4．Eros抗原区预测．671．5．间接ELISA。671．6．定点突变PCR改造全长cDNA质粒．．671．7．重组病毒的构建及拯救．692．结果692．1．猪瘟病毒C株Eros蛋白B细胞抗原表位预测．．692．2．Eros核心抗原区连续缺失重组蛋白的表达纯化。692．3．Erns核心抗原区连续缺失重组蛋白反应性鉴定一702．4．猪瘟病毒C株Eros核心抗原区突变对病毒复制的影响702．5．猪瘟病毒SM株Ems核心抗原区突变对病毒复制的影响712．6．猪瘟病毒SM株Eros核心抗原区置换Flag和HA标签对病毒复制的影响7l2．7．嵌合病毒Eros核心抗原区突变对病毒复制的影响722．8．Eros核心抗原区多点连续缺失对嵌合重组病毒复制的影响。722．9．Eros核心抗原区多点连续缺失嵌合重组病毒不诱导兔体反应一733．讨论．73第五章携带牛病毒性腹泻病毒Erns基因重组猪瘟病毒C株的拯救与鉴定761．材料与方法781．1．细胞与病毒．781．2．菌株与载体．781．3．试剂与仪器．79III万方数据浙江大学博士学位论文目录1．4