编码内质网膜蛋白的基因hrtn3及其小鼠同源基因mrtn3的克隆与功能研究-cloning and functional study of the gene hrtn 3 encoding endoplasmic reticulum membrane protein and its mouse homologous gene mrtn 3.docx

中固饥和医科_夫学博f：研究生论文中文摘要 中固饥和医科_夫学博f：研究生论文 中文摘要 (蛋白的分泌过程包含一系列复杂而精密的步骤，其中涉及到许多细胞内外膜结 构如内质网、高尔基体、溶酶体、分泌泡的参与。现已发现在新合成蛋白质的分泌 过程中，许多蛋白质翻译后的修饰在内质网就已经开始，而这些修饰作用又将影响 蛋白质最终的功能。在此修饰过程中，内质网膜蛋白无疑发挥了关键作用。同时近 年来的研究表明，定位于内质网膜上一些蛋白质能够选择性地转运某些特定的新合 成的蛋白进入相应的细胞器。RTN是一种编码内质网膜蛋白的重要基因家族。目前 认为，不同组织分布的RTN成员分别参与某类或某些蛋白的加工运输：并且它与神 经细胞的分化、凋亡，中枢神经系统的轴突再生也密切相关J我们在批量分离和克 隆与脑发育及功能维持相关的QQ坠时，从人的胎脑文库中克隆到一个全长 cDNA--hRTN3及小鼠的同源基因mRTN3,它们均属于RTN(reticulon)家族。 hRTN3cDNA全长2559bp，含有一个编码236个氨基酸残基的开放阅读框架。序 列的第137—139位核苷酸为起始密码子，旁侧序列符合Kozak规律，在开放性阅读 框架5’上游有一个框内终止密码子，3’有典型的加尾信号，这些特点均显示该序 列为一全长的cDNA。此cDNA序列已送至GenBank登录，接受号为AFll92970，通过 BLAST比较发现，此cDNA编码的蛋白质与人的RTN家族成员具有显著同源性，因此 命名为hRTN3 m㈣reticulon3)。进一步分析发现，其N端42个氨基酸为hRTN3 所特有的，且富含丝氨酸，为潜在的磷酸化位点。羧基端与RTN家族成员的同源性 高，并且在此区域内，含有2个大的疏水区，提示该蛋白可能是一种膜蛋白。这些特 征与RTN蛋白家族中其他成员相符合。为了功能研究的需要，我们还克隆了来源于 小鼠脑文库的同源cDNAmR7№其全长2814bp，编码含有237个氨基酸残基的蛋白 质。比较后发现，两种cDNA的同源性达到88％，所编码的蛋白质氨基酸序列的一致 性达到93．7％。同时蛋白mRTN3的结构也具有人hRTN3的基本特点。／眵1 f多组织膜Nothern杂交显示，hRTN3在脑组织高表达，并具有3个转录本，分别 为2．3kb、2．6kb、4kb，但4kb转录本在脑中是特异表达的：脚舢也有包括三个转 录本，分别为1．8kb、2．8kb、4kb，然而它的表达谱却广泛得多：在脑、心、肝、 睾丸中有较强的信号，在胰、肺、骨骼肌、肾中也有一定的表达。在含有40多个样 品的组织分区膜点杂交显示，^厅7M在脑组织的表达量远远高于其他组织。其中在 脑组织中，以下丘脑、枕叶中表达量为最高，在非脑组织中，以具有分泌功能的甲 状腺、唾液腺、乳腺较高。以mRTN3的一段序列为模板设计原位杂交探针，用灌流 后小、大鼠的中枢神经系统切片作原位杂交，研究小鼠的mRTN3在中枢神经系统中 组织和细胞的分布。，续验结果显示mRTN3在大脑皮层、海马、丘脑、脑干的神经核 团及脊髓的非胶质细胞中有强信号。 !堕坐塑堕登查兰堂主里!塑生堡塞为进一步了解hRTN3蛋白的亚细胞定位，我们构建真核表达载体，使hRTN3cDNA !堕坐塑堕登查兰堂主里!塑生堡塞 为进一步了解hRTN3蛋白的亚细胞定位，我们构建真核表达载体，使hRTN3cDNA 编码区重组到绿色荧光蛋白基因的上游，并用脂质体(Lipofectamine)转染到CHO 细胞，48小时后得到高效表达。通过共聚焦显微镜观察到融合蛋白定位于细胞质中， 呈不均匀分布，结合hRTN3 C末端所具有的内质网膜的锚定序列KKXX，由此推断该 蛋白位于内质网膜。 f为获得抗体进行功能研究，我们对人hRTN3蛋白进行了原核表达与纯化，并制 备了多克隆抗体。以小鼠中提取的各组织的蛋白质进行SDS—PAGE电泳，Western杂 交显示得到的多克隆抗体有良好的特异性(hRTN3与mRTN3两种蛋白在c端的一致性 达到100％)。同时发现在小鼠脑组织中可见一条近50kDa左右的明显杂交带，在肝、 骨骼肌、肺中也有一定的信号。以特异性较好的hRTN3C端的多克隆抗体对小鼠中枢 神经系统切片进行免疫组化，结果提示mRTN3蛋白在小鼠中枢神经系统中广泛表达， 在大脑皮层、海马、齿状回、丘脑及中脑的神经核团、延髓、脊髓中的神经元高表 达。 为验证hRTN3与神经元分化的相互关系，以全反式维甲酸和8一Cl—cAMP分别诱 导分化神经母细胞瘤细胞株SH—SY5Y和神经胶质细胞瘤细胞株U251。取诱导分化后 不同时间段的细胞RNA做Northern杂交发现：随SH—SY5Y细胞株的分化，hRTN3表 达量明显减少；但在U251细胞株分化过程中，hRTN3表