牵牛子酒提取物对Lewis肺癌抗肿瘤和抗转移机制研究.docVIP

牵牛子酒提取物对Lewis肺癌抗肿瘤和抗转移机制研究 　　[摘要] 目的：观察牵牛子酒提取物对Lewis肺癌生长和转移的影响，研究其抗肿瘤机制。方法：体外采用MTT法和划痕实验检测牵牛子酒提取物对Lewis肺癌细胞生长和迁移的影响，吖啶橙染色检测细胞自噬，荧光黄传输检测细胞间连接通讯，Western blotting检测细胞中水通道蛋白1（AQP1）的表达。体内建立小鼠Lewis肺癌皮下移植模型和实验性肺转移模型评价牵牛子酒提取物的抗肿瘤和抗转移作用，电化学发光法检测荷瘤小鼠血清癌胚抗原（CEA）和β2微球蛋白（β2-MG），免疫组化法检测肺转移小鼠肺脏AQP1和缝隙连接蛋白Cx43表达。结果：牵牛子酒提取物对体外培养的Lewis肺癌细胞呈剂量依赖性生长抑制，明显阻止细胞迁移，降低细胞AQP1蛋白，促进细胞间连接通讯，减少癌细胞无血清自噬。体内实验，与未治疗的模型小鼠比较，牵牛子酒提取物呈剂量依赖性减缓肿瘤生长、阻止肿瘤转移、延长荷瘤小鼠存活时间，同时，牵牛子酒提取物也降低荷瘤小鼠血清CEA和β2-MG水平，能增强荷瘤肺组织间隙连接蛋白Cx43的免疫组化染色深度，减弱水通道蛋白AQP1的阳性染色密度。结论：牵牛子酒提取物能够阻止Lewis肺癌生长和转移，其机制可能与增强细胞间连接通讯和下调细胞水通道AQP1有关。 　　[关键词] 牵牛子酒提取物；Lewis 肺癌；细胞间连接通讯；水通道蛋白1 　　[收稿日期] 2013-07-08 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；河南省科技厅重点攻关项目（112101310308）；河南大学省部共建项目（SBGJ090704）；河南省高校青年骨干教师项目（2010GGJS-025） 　　[通信作者] *杜钢军，教授，TelE-mail：dgjlhh@163.com 　　转移是恶性肿瘤生物学行为最本质的特征，也是癌症患者死亡的主要原因。在癌转移的治疗上，西医目前主要采用手术切除、放疗、化疗等措施，虽然在一定程度上有治标的效果，远期疗效并不确切，且其毒副作用大，病人的承受能力有限，很多患者生存质量反较治疗前下降[1]。我国的传统医学认为痰浊内阻是肿瘤形成的关键因素之一，而“痰毒流注”是恶性肿瘤转移的病因和重要机制[2]。很多学者从细胞间质及细胞黏附因子等肿瘤发生和转移的内环境因素对痰症理论进行了研究，证实了肿瘤细胞和间质细胞之间的津液代谢失调和痰症之间的相关性[3]，很多临床实践也证实了肿瘤从痰论治的有效性[4]。因此，根据中医“病有主药”的原则筛选有特色的化痰药物成为中药治疗肿瘤的关键。 　　牵牛子是旋花科植物裂叶牵牛Pharbitis nil （L） Choisy或圆叶牵牛P. purpurea （L） Voigt的干燥成熟种子，性寒味苦，有泻下通便、消痰涤饮，杀虫攻积等作用[5]。牵牛子的消痰涤饮作用符合中医肿瘤从痰论治原则，杀虫攻积有可能直接抑制肿瘤生长，而泻下通便可以引邪外出。综合分析，牵牛子有可能具有多方面抗肿瘤、抗转移作用，符合特色化痰药物抗肿瘤的候选条件。结合酒有温通经脉、引行药势之功，本研究观察了牵牛子酒提取物的抗肿瘤抗转移作用，并探讨了其可能的机制。 　　1 材料 　　1.1 动物 C57BL/6小鼠，雄性，体重18～22 g，北京维通利华试验动物有限公司提供，实验动物合格证号SCXK（京饲养于河南大学实验动物中心，自由饮食及饮水。 　　1.2 中药制备 牵牛子购自开封市天济堂药店，经河南大学药学院丛悦教授鉴定为旋花科植物牵牛P. nil的种子。牵牛子酒提取物由本校药物研究所制剂室制备：牵牛子粉碎过40目筛，加入10倍量体积分数52%的泸州老窖白酒60 ℃超声提取40 min，抽滤，提取2次，合并2次抽滤液，减压浓缩致干，用时加水溶为所需浓度供动物实验用，水溶液无菌过滤后供细胞实验用。 　　1.3 试剂与仪器 DMEM培养基（美国Gibco-BRL）；MTT（美国Sigma公司）； 标准胎牛血清（天津市源洋生物制品科技有限责任公司）；荧光黄（LY）（美国Sigma公司）；Cx43和AQP1兔抗鼠多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；羊抗兔IgG-HRP（武汉博士德生物工程有限公司）；HDL洁净台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；UV-2000型紫外-可见光分光光度计（上海尤尼柯仪器有限公司）； LGR16-W型高速冷冻离心机（北京京立离心机有限公司）；800型酶标仪（Bio-Tek）；DYY-7C电泳仪；XDS-500D型倒置荧光显微镜（上海蔡康光学仪器有限公司）。 　　2 方法 　　2.1 细胞增殖检测 取对数生长期的LLC细胞，用0.25%胰酶消化，调整细胞数5×104个/mL，以每孔100 μ