穿心莲内酯衍生物炎琥宁对大鼠体内白念珠菌生物膜影响.docVIP

穿心莲内酯衍生物炎琥宁对大鼠体内白念珠菌生物膜影响 　　[摘要] 目的：探讨穿心莲内酯（AG）衍生物炎琥宁（YHN）对大鼠体内白念珠菌生物膜的影响。方法：构建白念珠菌生物膜大鼠皮下导管模型，采用YHN（40，20，10，5，2.5 mg?kg-1）腹腔注射治疗，设氟康唑（FLC）阳性对照组（80 mg?kg-1），7 d后计数导管的菌落形成单位（CFU），XTT代谢法评估YHN对体外白念珠菌生物膜的影响；扫描电镜（SEM）观察YHN干预大鼠体内生物膜的形态变化；采用实时荧光定量PCR法检测白念珠菌黏附相关基因ALS1，ALS3，HWP1，EAP1和MP65的表达量。结果：YHN组导管片上CFU明显少于空白组；XTT代谢活性也显示YHN组低于空白组，且呈剂量依赖性；扫描电镜照片显示YHN能显著减少白念珠菌对大鼠体内导管的黏附；qRT-PCR结果显示，YHN可下调ALS1，ALS3，HWP1，EAP1和MP65的表达量。结论：YHN能抑制大鼠体内白念珠菌生物膜。 　　[关键词] 穿心莲内酯；炎琥宁；白念珠菌；生物膜；体内模型 　　[收稿日期] 2013-12-22 　　[基金项目] 国家自然科学基金项目；安徽中医药大学自然科研项目（2013zr009，2013RC001） 　　[通信作者] 汪长中，教授，TelE-mail：ahwcz63@ 　　[作者简介] 施高翔，硕士研究生，TelE-mail：ssjlsgx@163.com 　　白念珠菌Candida albicans是临床最常见的条件致病性真菌，可引起多种浅表及深部真菌病。近年来由于广谱抗生素等的广泛应用以及器官移植和介入性诊疗技术的普遍开展，真菌感染中由念珠菌所致的机会性感染高达73.4%，其中又以白念珠菌感染最为常见[1]。白念珠菌的致病性与其形成生物膜密切相关 。Chandra J等[2]将白念珠菌生物膜的形成划分为 3个阶段：早期以酵母相黏附于介质表面；中期白念珠菌细胞分泌细胞外多聚基质（ECM）覆盖于菌落表面；成熟期可见ECM包裹着细胞，内有大量菌丝生长。相对于浮游菌，白念珠菌生物膜的一个重要特征是其对临床抗真菌药物的高度耐药性。 　　我国中草药资源极其丰富，其在防治念珠菌感染中显示了较好的优势。炎琥宁注射剂为穿心莲内酯（AG）二琥珀酸半酯钾钠盐，可直接溶于水，药理研究及临床应用表明其具有抗菌、抗病毒等作用[3]。本课题组在前期研究中发现，中药单体AG（andrographolide，AG）及其衍生物对白念珠菌生物膜具有一定的抑制作用[4]。本实验通过构建大鼠皮下导管白念珠菌生物膜模型，初步探讨AG衍生物炎琥宁（YHN）体内抗白念珠菌生物膜作用。 　　1 材料 　　1.1 菌株与试剂 白念珠菌C. albicans SC5314由第二军医大学药学院姜远英教授惠赠。炎琥宁（AG的脱氢琥珀酸半酯钾钠盐，批重庆药友制药有限责任公司，以下简称YHN）；氟康唑（中国食品药品检定研究院，批号100314）；25%戊二醛溶液（国药集团化学试剂有限公司，批；地塞米松磷酸钠注射液（5 g?L-1，辰欣药业股份有限公司）；RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）；XTT [2，3-bis（2-methoxy-4-nitro-5-sulfo-phenyl）-2H-tetrazolium-5-carboxanilide]（加拿大BBI公司）；维生素K3（美国Alexis公司）。 　　1.2 仪器 Spectra Max M2e多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；96孔培养板（美国Corning公司）；扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM，Sirion 200，荷兰FEI公司）；离心机（长沙英泰仪器有限公司）。 　　1.3 动物 健康清洁级雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠84只，体重（200±20） g，购于安徽医科大学实验动物中心。随机分为 7组：空白对照组、YHN组（40，20，10，5，2.5 mg?kg-1）、氟康唑（FLC）阳性对照组（80 mg?kg-1），每组12 只；实验前3 d至实验结束以1 mg?L-1地塞米松掺入大鼠饮用水中进行免疫抑制。 　　2 方法 　　2.1 白念珠菌悬液和导管片的制备[5] 从4 ℃保存的白念珠菌沙氏培养基上挑取单菌落白念珠菌，接种至6 mL 1640培养液，于37 ℃恒温培养箱孵育16 h，再次活化，16 h后用血细胞计数板计数，以RPMI-1640培养基稀释浓度至2×106CFU/mL备用。将医用聚氨酯导管（直径2.4 mm）裁割成长1 cm的导管片