红花中黄酮类化合物分离与体外抗氧化研究.docVIP

红花中黄酮类化合物分离与体外抗氧化研究 　　[摘要]采用体外抗氧化活性（包括DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和FRAP法）为导向，筛选红花抗氧化活性部位，随后对活性部位进行成分分离与抗氧化效应评价。从红花活性部位水部位中分离得到5个成分，分别鉴定为6-羟基山柰酚-3，6，7-三-O-β-D-葡萄糖苷（1）、6-羟基山柰酚-3-O-β-芸香糖苷-6-O-β-D-葡萄糖苷（2）、6-羟基山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷（3）、羟基红花黄色素A（4）和脱水红花黄色素B（5）。通过对红花不同极性部位和单体成分进行抗氧化效应比较，发现水部位的抗氧化活性较显著，从中分离得到6-羟基山柰酚糖苷类和醌式查尔酮碳苷类主要活性物质。 　　[关键词]红花；抗氧化；活性物质；6-羟基山柰酚糖苷；醌式查尔酮碳苷 　　红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥花，味辛、微苦，归心、肝经，具有活血通经、散瘀止痛的功效。红花作为传统活血化瘀中药治疗中风、冠心病和心绞痛已有2 000多年的历史，始载于《开宝本草》[1-2]。红花水提物制成的红花注射液收载于卫生部药品标准中药成方制剂二十册中，临床上广泛用于心血管疾病的治疗。迄今从红花中分离得到200多种化合物，包括醌式查尔酮苷类、黄酮类、亚精胺类、生物碱类、倍半萜类、有机酸类、烷基二醇类、多炔类和甾体类等，其中很多的黄酮类和醌式查尔酮苷类成分已报道具有抗氧化和清除自由基的活性[3-4]。现代研究发现，机体抗氧化能力降低、氧化与抗氧化失衡，会导致自由基和活性氧产生过多，而自由基和活性氧具有损伤细胞结构、氧化抗凝血酶、脂质过氧化等作用，因此抑制自由基反应和活性氧生成是缓解许多心血管疾病的重要途径[5]。为了深入探讨红花的抗氧化活性物质，本文采用活性追踪的化学成分分离研究模式，先对石油醚、乙酸乙酯和水3个部位进行体外抗氧化效应评价，随后对活性较明显的部位进行化学成分分离及活性评价，旨在筛选获得红花抗氧化活性物质，为揭示红花药效物质与相关作用机制奠定基础。 　　1 材料 　　1.1 药物及试剂 　　红花为菊科植物红花C. tinctorius的干燥花，购自于安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，并经南京中医药大学王春根教授鉴定，符合《中国药典》（2010年版）项下标准。 　　DPPH（1，1-di-phenyl-2-picryhydrazyl）购自于ALDRICH Chemistry，ABTS（2，2′-azinobis-3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid）、三吡啶三嗪（2，4，6-tripyridyl-s-triazine，TPTZ）购自Sigma公司。超纯水自制，甲醇（色谱纯，中国汉邦），其他试剂均为分析纯。 　　1.2 仪器 　　YRE-301旋转蒸发仪（巩义市予华仪器有限责任公司）；超纯水仪（南京易普易达科技发展有限公司）。Waters 2695-2998 PDA，Empower2色谱工作站，Hypersil ODS2分析色谱柱（4.6 mm×250 mm， 5 μm）。Waters自动纯化系统（2545二元高压梯度泵，2767自动进样及收集器，泵控制器，2489双波长检测器，FractionlynxTM工作站），XBridgeTM C18 OBDTM制备柱（30 mm×150 mm， 5 μm）。WRS-1B数字熔点测定仪（未校正）；德国Bruker Avance AV-500/300核磁共振仪（TMS为内标）；Synapt MS飞行时间二级质谱仪（QTOF）；Enspire型多功能酶标仪（美国Perkin Elmer公司）。SephadexTM LH-20（GE Healthcare Bio-Sciences AB）；D101型大孔吸附树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）。 　　2 方法 　　2.1 红花各部位的制备 　　称取红花药材15 kg，分别用95%，70%乙醇渗漉至无色，合并渗漉液，减压回收乙醇，得浸膏约1 950 g。将浸膏混悬于水中，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取。分别合并各部位萃取液，减压回收溶剂，得到石油醚部位（CTP，约580 g）、乙酸乙酯部位（CTE，约335 g）和水部位（CTW，约1 000 g）。 　　2.2 化合物分离制备 　　2.2.1 柱色谱分离制备 CTW通过D101大孔树脂柱色谱，纯水洗至Molish反应为阴性后，依次用5%，30%，50%，95%乙醇洗脱，减压回收溶剂，得到4个洗脱部位。经UPLC-QTOF-MS分析发现，水部位含有的色素和黄酮类成分在30%洗脱部位得到大量富集。30%洗脱部位经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以水-甲醇（100∶0～0∶100）梯度洗脱，得到30部位（Fr）。