马尾松毛虫质型多角体病毒p44、p50蛋白表达与定位-expression and localization of p44 and p50 protein of dendrolimus punctatus qualitative polyhedrosis virus.docxVIP

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2018-07-27 发布于上海
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马尾松毛虫质型多角体病毒p44、p50蛋白表达与定位-expression and localization of p44 and p50 protein of dendrolimus punctatus qualitative polyhedrosis virus

PAGE PAGE VI ABSTRACT protein localization experiments result provides a reference method for other study of RNA viruses protein localization. Results of this experiment provided relevant experimental basis to explore the mechanisms of insect infestation by DpCPV. Key Words: Dendrolimus punctatus cytoplasmic polyhedrosis virus (DpCPV); Polyclonal antibodies;Prokaryotic expression; Eukaryotic expression 目录目录目录摘要 I ABSTRACT II 目录 IV 第一章引言 1 1 .1 质型多角体病毒概述 1 1.1.1 质型多角体病毒的发现 1 1.1.2 质型多角体病毒的分类与命名 1 1.1.3 质型多角体病毒的结构 2 1.1.4 质型多角体病毒的入侵机制 3 1.1.5 质型多角体病毒在害虫防治方面的应用 4 1.2 马尾松毛虫质型多角体病毒概述 5 1.2.1 DpCPV 的基本特性 5 1.2.2 DpCPV 基因结构及编码蛋白的特性分析 5 1.2.3 结构蛋白 P50 的切割修饰现象 6 1.2.4 DpCPV 国内外研究进展 7 1.3 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统 8 1.4 研究的内容及意义 9 第二章 DpCPV s7、s8 基因片段的原核表达和抗体制备 10 2.1 材料 10 2.1.1 病毒、菌株和质粒 10 2.1.2 实验仪器和试剂 10 2.1.3 溶液配制 10 2.1.4 培养基配制 12 2.1.5 引物信息 12 2.1.6 测序 13 2. 2 方法 13 2.2.1 病毒的增殖 13 2.2.2 多角体的纯化和病毒基因组 dsRNA 的提取 13 2.2.3 DpCPV s7 和 s8 ORF 全长的扩增 14 2.2.4 连接 T 载体 17 2.2.5 转化 17 2.2.6 质粒提取 18 2.2.7 酶切及酶切产物的纯化 19 2.2.8 连接表达载体 pET28a 19 2.2.9 转化 20 2.2.10 重组质粒 pET28a- s7 和 pET28a- s8 提取 20 2.2.11 双酶切表达载体鉴定阳性克隆子 20 2.2.12 测序以及序列分析 21 2.2.13 蛋白的诱导表达 21 SDS凝胶的制备 21 SDS检测表达蛋白 22 2.2.16 细胞的破碎 23 2.2.17 蛋白纯化 23 2.2.18 多克隆抗体的制备 24 2.2.19 抗血清的 Western blot 检测 24 2.3 结果 25 2.3.1 马尾松毛虫质型多角体病毒基因组片段的提取与纯化 25 2.3.2 DpCPV s7 和 s8 全长的扩增 26 2.3.3 各目的片段与表达载体连接亚克隆得到重组质粒的酶切分析 26 2.3.4 测序结果与分析 27 2.3.5 P44 和 P50 原核表达分析 27 2.3.6 多克隆抗体的 Western blot 检测 28 2.4 小结 29 第三章 DpCPV s7 和 s8 编码蛋白的真核表达与定位 31 3.1 材料 31 3.1.1 质粒、菌株和细胞系 31 3.1.2 试剂 31 3.1.3 溶液 31 3.1.4 培养基 32 3.1.5 引物信息 32 3.2 方法 32 3.2.1 重组 Bacmid 病毒的构建 32 3.2.2 重组病毒转染昆虫细胞 Sf9 38 HYPERLINK \l _TOC_250000 3.2.3 Western blot 检测 39 3.2.4 细胞定位 39 3.3 结果 39 3.3.1 重组病毒载体构建 39 3.3.2 P50 和 P44 的真核表达的 SDS检测 41 3.3.2 P50 和 P44 的真核表达的 Western blot 检测 42 3.3.3 结构蛋白 P50 的亚细胞定位 43 3.4 小结 44 第四章结论与展望 46 4.1 结论 46 4.1.1 DpCPV s7 编码相对分子量为 50kDa 的蛋白 P50 46 4.1.2 DpCPV s8 编码相对分子量为 44kDa 的蛋白 P44 46 4.1.3 P44