酿酒酵母spc29p磷酸化对nsfi1p与spc29p之间相互作用的影响-酿酒酵母29p磷酸化对科学基金1p与29p之间相互作用的影响.docxVIP

中文摘要在酿酒酵母细胞中，纺锤体极体(spindlepolebody,SPB)是它的微管组织中心，在维持细胞遗传稳定性上发挥着极其重要的作用，与高等动物细胞的微管组织中心即中心体有着很多同源的蛋白组分，高度保守和相似的复制和分离调控机制，已经成为中心体复制与分离研究的模式细胞器。SPB由SPB主体和半桥两部分组成。Sfi1p是SPB必需的半桥蛋白，缺失或突变会导致SPB复制失败，对SPB正常功能的维持具有十分重要的作用，并且在人类中心体中也存在其同源蛋白hSfi1p。Spc29p是构成SPB中央斑块的必需卷曲螺旋蛋白，是SPB主体蛋白组分，限制温度下Spc29p的温度敏感突变会导致SPB无法复制。实验室前期的研究结果表明Spc29p与Sfi1p的N端之间存在强烈的相互作用，这对于早期的SPB的复制是非常重要的，第一次揭示了SPB主体和半桥之间有直接的联系。Spc29p在4个磷酸化位点T18、T159、S187和T240处被蛋白激酶Mps1p磷酸化。本论文对Spc29p的磷酸化对其与N-Sfi1p之间相互作用的影响进行了初步研究，并进一步探讨了Spc29p磷酸化对SPB自我组装过程的影响。该研究为SPB复制过程的深入研究提供了科学指导，也对人类中心体的相关研究具有重要的借鉴意义。本文通过融合PCR、定点诱变技术及其他克隆手段对SPC29磷酸化位点处的基因序列进行修饰，构建出处于消除磷酸化状态的突变质粒pGAD424-spc29-T18A、-T159A、-S187A和-4A以及处于模拟磷酸化状态的突变质粒pGAD424-spc29-T18D、-T159D、-S187D和-4D，经过测序分析正确，另外，包括实验室收藏的质粒pGAD424、pGBT9、pGAD424-SPC29、pGBT9-SPC29、pGBT9-SFI1-NT(1-250)，及质粒pGAD424-spc29-T240A、-T240D。将携带有SFI1-NT的BD载体pGBT9和携带有SPC29或spc29各等位基因的AD载体pGAD424共同转化酵母菌PJ69-4a。通过酵母双杂交实验对Spc29p磷酸化机制对其与N-Sfi1p之间相互作用的影响进行了初步研究。实验结果显示模拟磷酸化状态的spc29-4D与SFI1-NT的相互作用与消除磷酸化状态的spc29-4A相比明显降低，表明Spc29p的磷酸化对其与N-Sfi1p的结合有调节作用且为负调控，即Spc29p磷酸化降低了其与N-Sfi1p之间的亲和力，削弱了两者之间的相互作用，进一步影响了SPB主体与半桥之间的结合。因此，Spc29p磷酸化作用可能构成了一种新型的调控酵母细胞SPB复制的作用机制。关键词：酿酒酵母；纺锤体极体；Spc29p；磷酸化；Sfi1pABSTRACTIntheyeastSaccharomycescerevisiaecells,thespindlepolebody(SPB)actsasthemicrotubuleorganizingcenterandplaysanimportantroleincelldivisionandgenomestability.Itsharesanumberofhomologousstructuralcomponentsandregulatorswiththecentrosome,whichismicrotubuleorganizingcenterinthemammaliancells,andsomeparallelsintheprocessoftheirduplicationandseparationcanalsobeseen,whichmakestheyeastSPBausefulmodelforstudyingtheprinciplesandmechanismsgoverningcentrosomeassemblyandseparation.SPBconsistsoftwosubstructures,thecoreSPBandthehalfbridge.Sfi1pisanessentialcomponentofSPB,whichlocalizesathalfbridgeandspansitsfulllength.Sfi1p,whosedeletionormutationcausesafailureofSPBreplication,isrequiredforSPBduplicationandself-assembly.AlargenumberofstudiesshowthatSfi1phasitshomologousproteinhSfi1pinthemammaliancentrosome.Spc29pisanecessarycoiled-coilelement