天然产物与oatp1b1相互作用的研究和oatp2b1n-糖基化对功能和表达的影响-study on the interaction between natural products and oat 1b1 and the effect of oat 2b1 n - glycosylation on its function and expression.docxVIP

天然产物与OATP1B1相互作用的研究和OATP2B1N-糖基化对功能和表达的影响中文摘要有机阴离子转运多肽（OATP）1B1是重要的肝摄取转运蛋白，介导很多内源性物质和外源性药物转运到肝细胞。为了鉴别和研究天然产物中潜在的OATP1B1的调节剂，本实验采用稳定表达OATP1B1的中国仓鼠卵巢细胞（CHO），在96孔板中测定了21种常见天然化合物和提取物对OATP1B1介导荧光素甲氨蝶呤转运的影响。该方法可进一步应用于高通量筛选大化合物库。结果表明：若干黄酮类化合物（如槲皮素、槲皮苷、芦丁、菊花梗叶总黄酮和桑皮黄素等）和三萜类化合物（如甘草次酸和甘草酸等）在体外实验中显著抑制了OATP1B1的转运功能，其IC50值均小于16μM；黄酮类化合物比其对应的糖苷类化合物的抑制作用更强，而且糖的类型和糖链长度对其抑制作用均有影响。为了考察这些化合物对OATP1B1介导其他底物摄取的影响，我们建立了检测OATP1B1药物底物氟伐他汀和罗伐他汀的LC-MS/MS方法。研究结果表明，天然产物对OATP1B1转运功能的影响具有底物依赖性。本论文的研究结果将有助于预测和避免潜在的OATP1B1介导的不良药物-药物和药物-食物相互作用，为临床合理用药提供实验依据和指导。有机阴离子转运多肽2B1（OATP2B1）表达在胎盘、肝脏、乳腺、脑和肠等组织中，介导四溴酚酞磺酸钠、3-硫酸雌酮和3-硫酸脱氢表雄酮等的转运。糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰，OATPs的共有结构特征—潜在的N-糖基化位点位于胞外环2和5上。为探究OATP2B1上N-糖基化对其表达及功能的影响，我们首先使用生物信息学软件预测4个潜在N-糖基化位点，并该对应位点处的将天冬酰胺突变成谷氨酰胺，得到四个单突变（N146Q、N176Q、N350Q和N538Q）和一个双突变（N176/538Q）。然后对于这些OATP2B1突变体的功能和表达的评估实验在HEK293细胞中进行。结果表明：OATP2B1上的天冬酰胺176和538是糖基化位点。当这两个位点被分别突变时，均使得蛋白水平降低以及转运活性显著降低；当两个位点被同中文摘要天然产物与OATP1B1相互作用的研究和OATP2B1N-糖基化对功能和表达的影响时突变时，蛋白水平显著下调，同时转运功能基本丧失。这表明N-糖基化对OATP2B1的功能和表达非常重要。关键词：有机阴离子转运多肽；天然产物；药物-药物相互作用；液相色谱-质谱；N-糖基化作者：石美智指导老师：贵春山张洪建StudiesoftheinteractionsbetweennaturalproductsandOATP1B1andtheeffectofN-glycosylationonthefunctionandexpressionofOATP2B1AbstractOrganicaniontransportingpolypeptide1B1(OATP1B1)isanimportantliver-specificuptaketransporter,mediatingtransportofnumerousendogenoussubstancesanddrugsfrombloodintohepatocytes.ToidentifyandinvestigatethepotentialmodulatorsofOATP1B1fromnaturalproducts,theeffectof21frequentlyusednaturalcompoundsandextractsonOATP1B1-mediatedfluoresceinmethotrexatetransportwasstudiedbyusingChinesehamsterovary(CHO)cellsstablyexpressingOATP1B1in96-wellplates.Thismethodcanbeusedforthescreeningoflargecompoundlibraries.Ourresultsshowedthatsomeflavonoids(e.g.quercetin,quercitrin,rutin,chrysanthemumflavonoidsandmulberrin)andtriterpenoids(e.g.glycyrrhetinicacidandglycyrrhizicacid)wereinhibitorsofOATP1B1withIC50valueslessthan16μmol·L-1.Flavonoidsshowedmuchhigherinhibitionactivitythantheirglycosides.Furthermore,thetypeandlengthofsaccharideshadasi