AGEs对人肾小管上皮细胞Fractalkine mRNA表达影响.doc

AGEs对人肾小管上皮细胞Fractalkine mRNA表达影响 　　[摘要] 目的:用体外培养的肾小管上皮细胞(TEC),观察糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)诱导下fractalkine (FKN,CX3CL1)mRNA的表达。方法:运用体外制备的糖基化修饰的牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA),按不同的浓度和时间干预TEC,以无血清培养基(DMEM)和不含葡萄糖BSA组(浓度为200 mg/L)为对照,用RT-PCR(逆转录聚合酶链式反应)检测FKN mRNA的表达。结果:TEC的FKN mRNA表达水平随着AGE-BSA浓度增加和干预时间延长而增加(P0.05),①随着AGE-BSA浓度(50、100、200、400 mg/L)的增高,细胞的FKN mRNA水平随之增高,100 mg/L以上各浓度组FKN mRNA显著高于对照组(P0.05);②随着干预时间(0、12、24、48)的延长,细胞FKN mRNA表达随之升高,各时间点AGE-BSA组FKN mRNA显著高于对应BSA组(P0.05)。结论:AGE-BSA可呈剂量及时间依赖性地增加TEC FKN的mRNA表达,提示AGEs可能部分通过FKN途径参与糖尿病肾小管病变的发生发展。 　　[关键词]糖基化终产物;fractalkine;糖尿病肾病 　　[中图分类号]R587.2 　　[文献标识码]B 　　[文章编号]1006-1959(2009)11-0015-02 　　糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微血管并发症之一,是导致终末期肾脏疾病最常见的原因。近期研究证实,糖尿病肾损伤不仅是肾小球的硬化,同时也发生在肾小管。许多研究显示糖基化终末产物(AGEs)形成与堆积是DN的主要发病机制之一[1]。近年来发现,细胞因子尤其趋化因子和糖尿病肾病的病理变化及临床表现密切相关。fractalkine(FKN) 是目前发现的趋化因子CX3C家族的唯一成员,它是否在AGEs致DN肾小管间质病变的发病机制中发挥重要作用,值得深入研究和探讨。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要试剂:新生小牛血清(杭州四季青生物工程材料研究所产品)、DMEM培养基(Gibco产品) 、Trizol总RNA提取试剂盒(TaKaRa产品)、RT-PCR试剂盒RevertAidTM First Stand cDNA Synthesis Kit MBI(Fermentas)产品、DNA Marker D2000(2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100bp)购自天为时代公司、FKN mRNA及β-actin mRNA引物委托上海生物工程公司合成。 　　1.1.2 AGE-BSA的制备:在PH 7.4的PBS溶液里加入BSA和不同量的葡萄糖,使BSA的终浓度为5.0 g/L,葡萄糖的终浓度为50 mmol/L,过滤除菌,PH 7.4 PBS溶液透析除去未结合的葡萄糖。对照组BSA中不含葡萄糖,其余条件一致。荧光光谱扫描分析鉴定AGE-BSA。 　　1.1.3 TEC的培养:首先将冻存的人肾小管上皮细胞(TEC)复苏,将细胞悬液移入培养瓶内,加适量培养液进行培养。 　　 　　1.2 方法 　　1.2.1 实验分组及干预:实验设AGE组、对照组。将处于对数生长期的细胞按1∶3移入6孔板中,待细胞生长至80%～90%融合时,换用无血清的DMEM同步化饥饿24h后进行干预:①分别加入不同浓度(50、100、200、400 mg/L)的AGE-BSA对TEC干预24h;②加入200 mg/L 的AGE-BSA对TEC分别干预0、12、24、48h。用不含葡萄糖BSA和无血清培养基DMEM作为对照。 　　1.2.2 半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测FKN mRNA表达:按Trizol总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA,取2μg为模板逆转录。应用RT-PCR试剂盒进行FKN及β-actin的cDNA第一链合成,总反应体积25μl。取2μl cDNA进行PCR扩增,以1.7%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,用自动凝胶图像分析仪扫描凝胶图谱,用LabImage分析软件对DNA条带进行密度扫描分析,以特意扩增产物条带光密度值与内参照条带光密度值之比值作半定量分析。 　　 　　1.3 统计学处理:计量数据以均数±标准差(x±s)表示,应用SPSS13.0统计软件分析数据,采用one-way ANOVA进行显著性检验,组间比较采用S-N-K检验,P0.05为差异有显著性。 　　 　　2 结果