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CRISPRCas9技术应用研究进展 　　【摘 要】 成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）是存在于细菌和古细菌中的获得性免疫系统，通过其转录产物crRNA（CRISPR RNA）及CRISPR相关蛋（CRISPR-associated，Cas），尤其是Cas9蛋白特异性抑制入侵的DNA。该系统由于其快捷靶向以及其作为一种特定位点核酸酶的高效性和多重修饰的可能性，被广泛应用于基因编辑领域。本文主要从CRISPR/Cas9系统的相关概念及原理、技术研究进展、应用研究进以及CRISPR/Cas9技术应用的未来发展进行阐述。 　　【关键词】 CRISPR CRISPR/Cas Cas9 基因编辑 　　基因编辑是指对基因组或表达产物（RNA）进行针对性修饰的过程。真核生物基因组包含上亿万个碱基，很难对其进行精确的修饰。但如果能够简单有效地做到，将会极大地推动生物学基础理论、医药及生物技术等方面的研究的进展。CRISPR/Cas9作为新一代的基因编辑技术，有着其它技术无可比拟的优势。理论上，在基因组中每8bp就有一个适合 CRISPR/Cas9编辑的位点。基于CRISPR/Cas系统的作用原理，研究人员通过体外人工合成sgRNA（small-guide RNA）与Cas9蛋白的复合物，成功实现对特定基因片段的精确剪切，由此开创了一种通过构建RNA序列介导Cas蛋白识别并剪辑靶基因的新型基因编辑技术。由于该技术的高效性、低成本性和简易性，对于CRISPR/Cas9系统的研究受到各界密切关注，而且在越来越多的研究领域得到应用。 　　1 CRISPR/Cas9技术的基本原理 　　CRISPR/Cas9的基本结构包括tracrRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）序列区、cas（CRISPR associated system，cas）基因序列区、CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）序列区，3个功能区在 　　DNA链上呈线性排列。CRISPR序列区含多个重复序列（R区）和间隔序列（S区），间隔序列被呈半回文结构的重?托蛄懈艨?。CRISPR序列区可编码crRNA（CRISPR RNA），故又被称为crRNA序列区。Cas基因区临近CRISPR序列区，cas基因种类有很多，其中cas9 基因编码Cas9核酸酶，该酶受crRNA引导，对DNA靶序列进行切割。CRISPR/Cas系统分为三种类型：TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ，而在化脓链球菌中发现的CRISPE/Cas9系统属于TypeⅡ型。 　　CRISPR/Cas9系统在噬菌体中起到免疫作用，当噬菌体首次入侵宿主时，cas基因编码的蛋白复合物会裂解噬菌体DNA上短间隔序列，并将裂解片段整合入自身DNA的CRISPR序列5’端。当同种噬菌体再次侵入时，整合了噬菌体DNA片段的CRISPR位点会转录出crRNA，在crRNA与一段tracrRNA结合成为二元复合体后，与噬菌体DNA 20nt 的长度互补配对，继而引导Cas9核酸酶切割结合位点[1]。 　　2 CRISPR/Cas9技术的新发展 　　Samuel等[2]建立了一个模块化的存储单元，利用自我靶向RNA（stgRNA）记录细胞内分子事件，从而使它能被反复的改写来生成新的序列。他们设计了一个自我靶向向导RNA（stgRNA），它可以不断地靶向、诱变编码它的DNA。在巨细胞病毒启动子和规范ATG起始密码子的下游，他们嵌入了一个突变检测区（MDR）。这个可变区是由stgRNA位点和紧随它的改良后的u6启动子组成。MDR直接在不同阅读框的绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）基因后面，GFP和RFP被相应的不同阅读框的“2A自我分裂（切割）多肽”分开。不同的阅读框架是否与起始密码子同框，这取决于MDR中插入缺失的大小。不同数量的碱基删除会产生不同的移码突变，从而表达不同的荧光蛋白。进而记录细胞内分子事件。 　　在基因编辑技术方面，CRISPR/Cas9系统以其简洁性、高效性已被广泛用于基因编辑，但同时也存在着脱靶的现象。Feng Zhang等[3]在构成化脓性链球菌 Cas9酶的约 1400个氨基酸中，通过改变 3个氨基酸将“脱靶编辑”显著减少至无法检测到的水平。该研究小组将这种新设计的酶命名为 “增 强 型 ”化 脓 性 链 球 菌 Cas9 （SpCas9），可用于需要高水平特异性的基因组编辑应用。 　　3 CRISPR/Cas9技术在疾病研究中