SRAPISSR和RAPD分子标记技术在银耳菌株鉴别上应用.docVIP

SRAPISSR和RAPD分子标记技术在银耳菌株鉴别上应用 　　选用4个银耳（TremellafuciformisBerk.）菌株T6、T7、T8和T9，应用SRAP、ISSR和RAPD标记法探讨分子标记技术在银耳菌株鉴定上的适用性。结果表明，实验范围内12对SRAP引物，10条ISSR引物，8条RAPD引物适合银耳菌株鉴定分析。3种标记法的鉴别结果一致,都将4个银耳菌株分成3组，T6，T8，T7和T9。分析结果比较表明，RAPD引物扩增到的多态性条带最多，4个银耳菌株遗传相似性平均值为81.34％。SRAP标记反映的遗传信息最丰富，遗传相似性平均值为68.98%。ISSR所反映的遗传信息介于前两种标记之间，遗传相似性平均值为77.48%。?? 　　SRAP；ISSR；RAPD；银耳?? 　　S567.34??A 　　 　　DNA分子标记技术是基于生物个体间或种群间基因组DNA某一片段的不同而反映生物个体或种群间的差异，被广泛应用于遗传多样性分析,系统发育分析，遗传图谱构建，基因定位及克隆，分离菌株的鉴定等方面［1］。?? 　　20世纪80年代出现的限制性长度多样性（RFLP）和90年代出现的随机扩增多态性DNA（RAPD），已广泛应用到香菇（Lentinulaedodes）［2］、草菇（Volvariellavolvacea）［3］、木耳（Auriculariaauricula）［4-6］、金针菇（Flammulinavelutipes）［7］、侧耳属（Pleurotus）菌种［8，9］、（松口蘑Tricholomamatsutake）［10］、双孢蘑菇（Agaricusbisporus）、大肥菇（Agaricusbitorquis）［11］和灵芝（Ganodermalucidum）［12］等食用菌遗传多样性、菌株鉴别和育种研究中。1993年，PARAN和MICHELMORE将RAPD标记转化为SCAR标记更有效地进行菌株区分。吴学谦等［13］由RAPD开发出SCAR标记对香菇菌株进行快速鉴定，获得了所试菌株特异SCAR标记。宋春艳等［14］获得了香菇135菌株的SCAR标记。AFLP、ISSR、SRAP、TRAP等分子标记技术也广泛应用在香菇、灵芝等多种食用菌的菌株鉴别中。?? 　　银耳(TremellafuciformisBerk.)是我国特有的栽培食用菌种类，与伞菌相比其子实体形态分化相对简单，以形态特征为依据进行菌株区分比较困难。因此，进行银耳菌株的分子标记鉴定技术研究，对银耳遗传育种工作有重要实用价值。本试验应用SRAP、ISSR和RAPD3种分子标记技术对银耳菌株进行鉴定鉴别研究，试图建立银耳菌株分子鉴定鉴别的技术和方法。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1??供试菌株 　　银耳菌株：由福建省古田县兴华真菌研究所提供，分别编号为T6、T7、T8和T9，相关性状见表1。?? 　　1.2?κ笛榉椒? 　　1.2.1??基因组DNA的提取 　　选用原种菌瓶表面形成的幼耳作为DNA提取的材料。由于银耳多糖含量高，本实验先用CTAB??free缓冲液（200mmol/LTris??HCl，50mmol/LEDTA，250mmol/LNaCl，1%巯基乙醇）洗涤液氮研磨物，0.5g组织研磨物于0.6mL缓冲液中混匀，8000r/min(4722×g)离心5min,取沉淀物按CTAB法［15］提取DNA。 　　 　　1.2.2??SRAP标记 　　根据LI和QUIROS［15］设计10对正向/反向SRAP引物（见表2），本实验随机组合从中选出12对引物。?? 　　PCR反应：BIO??RADicyclerPCR仪扩增，反应体积25μL，各成分终浓度为：1×PCRbuffer，1.0mMdNTPs，引物各0.4μM，0.625UExTaqDNA聚合酶（Takara公司），5ngDNA模板，最后加双蒸水补齐。循环体系采用复性变温法：94℃预变性5min，前5个循环（94℃1min，35℃1min，72℃1min），后35个循环复性温度提高到50℃，最后72℃延伸7min。?? 　　电泳和检测统计：2％琼脂糖凝胶电泳，恒压70V，电泳1h，于凝胶成像系统检测电泳结果。 　　1.2.3??ISSR标记 　　25条ISSR引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。编号及核苷酸序列见表3。?? 　　反应体积25μL，各成分终浓度为：1×PCRbuffer，0.8mMdNTPs，0.4μMISSR引物，0.5UExTaqDNA聚合酶(Takata公司)，4ngDNA模板，最后加双蒸水补平。反应条件为94℃预变性4min，（94℃变性1min，55℃复性1min，72℃延伸3min）×35，