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TGM2高表达对GES1细胞生长增殖影响 　　【中图分类号】R251 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）10-00-01 　　胃癌是我国最常见的十大恶性肿瘤之一，其发病率与死亡率均居消化道恶性肿瘤之首[1，2][3，4]，是危害人们的健康与生命的重大疾病之一。早期发现，早期治疗对胃癌防治具有十分重要的临床价值与意义。课题组前期运用定量蛋白质组学技术，发现组织型转谷氨酰胺酶（Tissue Transglutaminase，TGM2）蛋白在胃粘膜癌变过程中呈现表达逐渐升高[5]。然而，TGM2蛋白在胃粘膜癌变过程中的作用及机制仍需深入研究，本文旨在了解TGM2在永生化胃上皮细胞GES1增殖中的作用，为阐明胃癌发病的分子机制提供实验依据。 　　1 材料和方法 　　1.1 细胞系 　　永生化胃上皮细胞GES1和胃癌MGC803细胞购自中国医学科学院上海细胞生物研究所，用10%血清胎牛的RPMI1640培养基，置于37℃、5%CO2的培养箱常规培养。 　　1.2 质粒与主要试剂 　　pCDNA3.1真核表达载体由中南大学肿瘤研究所馈赠。高保真酶、T4DNALigandmerase购置宝生物工程（大连）有限公司。限制性内切酶HindIII和XhoI购置Fermentas公司。一抗与二抗购置SantaCruz公司。 　　1.3 引物 　　采用Premier6.0软件设计重组pCDNA3.1-TGM2和β-actin内对照引物，由上海英骏生物技术有限公司合成。 　　1.4 构建pCDNA3.1-TGM2真核表达质粒 　　收集胃癌MGC803细胞，抽提细胞总RNA，AMV逆转录后进行PCR扩增。反应扩增条件：96℃5min，94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，35循环，72℃10min。回收TGM2基因片断，纯化后用限制性内切酶HindIII和XhoI酶切，分离纯化后连接。将连接产物，转化DH5α感受态，选取菌落扩增，PCR和酶切鉴定，送invitrogen公司进行序列测定，即获得pCDNA3.1-TGM2真核表达质粒。 　　1.5 TGM2稳定表达细胞的建立 　　1.5.1 Western-blot检测TGM2蛋白的表达 　　将GES1细胞接种于6孔板中，采用Lipofactamine2000脂质体进行pCDNA3.1-TGM2真核表达质粒转染（pCDNA3.1为载体对照），G418筛选后汇合克隆，建立TGM2稳定表达的GES1细胞系，即GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1。提取细胞总蛋白质，以30?g/泳道的蛋白进行10%不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜后5%脱脂牛奶封闭，鼠抗人TGM2单抗（1：1000）与抗β-actin单体（1：2000）4℃孵育过夜，洗膜后羊抗鼠二抗（1：1000）室温孵育，洗膜、发光、曝光、显影与定影，分析TGM2蛋白的表达。 　　1.5.2 免疫荧光染色 　　将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞接种于预先放置盖玻片的6孔板中，制作细胞爬片，洗涤细胞，用甲醇与丙酮（1：1）混合液固定；洗涤细胞，0.1%TritonX-100室温孵育20min，洗涤细胞，用鼠抗人TGM2单抗（1：1000）37℃孵育1h，洗涤细胞，用FITC标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1h，洗涤细胞，甘油封片，制备细胞爬片，置于荧光显微镜下观察、拍照。 　　1.6 绘制细胞生长曲线 　　将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞接种于96孔培养板中，每组设3个平行孔（设空白对照孔），培养24h后，每孔加入20?L5mg/mL的MTT，培养4h，加入150?L的DMSO，溶解蓝紫色结晶物，置于酶标仪中用490nm波长测定吸光度值。每天检测一次，每次重复测量3次，取平均值进行校正（测量值与第一天测量值之商），校正值代表测量值，连续检测7天，将测量值绘制在坐标纸上，绘制细胞生长曲线。 　　1.7 细胞周期和凋亡检测 　　将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞用无血清RPMI1640培养细胞24h后，用血清培养基培养24h后，收集细胞，PBS洗涤，用4℃预冷70%乙醇固定2h，PBS洗涤，加入含20mg/LRNA酶Tris-HCl液，37℃孵育30min，用50mg/L碘化丙锭染色，收集送公司进行流式细胞术分析，检测细胞周期中各个时相比例与细胞凋亡率，计算细胞增殖指数，增殖指数（PI）=（S+G2）/（G0/1+S+G2）。 　　1.8 平皿克隆形成实验 　　将GES1-TGM2和GES1-pcDNA3.1细胞以500个/孔接细胞种于6孔板中，每组设3平行孔，静置培养1周后，用3：1甲醇与冰乙酸的混合液固定，?Y晶