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PCRSSCP技术在昆虫学研究中应用
PCRSSCP技术在昆虫学研究中应用
摘 要 聚合酶链式反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)技术是一种简便、灵敏的突变检测方法。随着该技术的不断发展和完善,其应用也越来越广泛。尤其是近年来该技术在昆虫学研究中涉及了:基因突变位点的检测、昆虫分类鉴定、多样性分析及连锁图谱的构建等多个领域。文章综述PCR-SSCP技术的发现、原理、在昆虫学研究中的应用及其优点和不足之处。
关键词PCR-SSCP,突变检测,连锁图谱
1984年,Noumi等人在对大肠杆菌的正常和突变F1-ATPase基因的研究中发现,该基因经过酶切后,在中性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)中电泳后,含突变位点的单链和正常的单链片段有不同的迁移速率。相同长度的DNA小片段,即使仅一个碱基不同,都能明显地分开。这种因碱基差异而引起的DNA片段迁移率不同的现象,叫单链构象多态性(single-strandconformation polymorphism,SSCP)。从该方法问世以来,经不断的发展,现在已经成为众多学科检测DNA突变和诱导损伤,及基因多态性分析的重要方法。
1 PCR-SSCP技术的基本原理
PCR-SSCP技术是通过非变性聚丙烯酰胺做介质,电泳合适大小的单链DNA(SSDNA)片段,然后显影观察SSDNA之间的迁移率的差异。该方法依据的原理是:单链DNA在适宜的条件下(如:稳定的低温,非变性的聚丙烯酰胺凝胶等),能折叠成各种构象。单链在非变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率和DNA分子大小无关,而取决于单链的分子构象,分子构象不同,其迁移速率就不一样。单链DNA的分子构象是由分子内部碱基决定的,其稳定性靠分子内局部顺序的相互作用(主要是氢键作用)来维持。因此不同的序列有不同的构像,即使只有1个碱基的差异,其单链的构象也不相同。后来研究的证据表明,影响迁移率的主要是ssDNA分子的三级结构而不是二级结构。
2 PCR-SSCP技术在昆虫研究中的应用
自1984年Noumi发现单链构象多态性现象后,该技术经过了一系列的发展和完善。Orita等首先将SSCP和PCR技术结合起来对PCR扩增的片段进行分析。1989年Hoshino等用银染法取代了放射性同位素对PCR-SSCP结果进行分析,增强了该项技术的安全性。为了进一步提高检测率,之后人们又发展起来了RNA-SSCP技术,以及将双脱氧测序、毛细管电泳法和SSCP结合起来,使SSCP方法具有更高的分辨率、检测率和重复性。
随着PCR-SSCP技术的不断发展和完善,其在各领域的应用也越来越广泛。Hiss,Norris等将该技术首次应用于昆虫研究,他们运用SSCP方法分析了蜱、叶蝉、蚊子和亲缘关系接近的内寄生蜂的部分12S或16S RDNA基因。银染后在所有的分类单元中都观察到了种的特异性条带,而种内在分子水平上的单碱基突变也能被检测到。此后,PCR-SSCP技术在昆虫研究中得到了广泛的应用。其主要包括以下几个方面。
2.1基因突变位点的检测
Morel等将果蝇的KCl67细胞经含低浓度的溴化乙锭(20ng/mL)的培养基培养,然后用PCR-SSCP方法分析mtDNA来检测突变。通过与对照组比较得出,用溴化乙锭培养的细胞能产生线粒体DNA突变。Zhang等运用SSCP方法分析了美国科罗拉多马铃薯瓢虫Henosepilachna vigintioctomaculata的AchE基因的部分片段(163bp),该片段含有$291G突变,根据此突变的有无来区别薯虫对谷硫磷的抗性和敏感个体。并通过测序来确认这一特异性点突变。同时还指出类似的方法可用于对任何抗性和敏感昆虫的点突变检测。Sunnucks等用SSCP方法检测了长管蚜Sitobion aphids EFlα基因的内含子突变,并以此来研究Sitobionaphids孤雌生殖的进化。同时还用该方法检测了Sitobion aphids相同长度微卫星片段的序列突变和mtDNA核酸的换位拷贝。
2.2用于昆虫分类鉴定
Burban等用PCR-RELP-SSCP方法分析了Matsucoccus feytaudi的线粒体DNA,并将其分为3个主要谱系,并确定这3个谱系与其寄主病史有明显的关系。Sedlmair等对Orinocarabus亚属进行分类学研究。运用SSCP技术分析该亚属的泛素基因(ubiquitin gene),获得种群特异性条带后绘制了树状图。且该图与传统的形态学分类不一样。Salvato等用ALFP和SSCP技术,对松异舟蛾Thaumetopoea pityocampa和异舟蛾Thaumetopoea wilkinsoni这2个同胞种9个种群的COⅠ和COⅡ
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