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PCR技术在动物检疫中新应用 　　中图分类号：S188　文献标识码：B　文章编号：1007-273X(2008)07-0014-02 　　 　　聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)技术自1985年建立以来，经过了20余年的发展，应用日益广泛，体现了其强大的生命力。对病原体核酸的扩增被广泛应用于动物病原体的检测中。并在动物检疫中发挥着越来越大的作用。 　　PCR作为现代分子生物学的核心技术，在科学研究和临床诊断中都发挥了巨大的作用。这项技术经过不断的开发和改进，已经应用到动物检疫领域的各个环节。给我们的工作带来极大的便利。在PCR技术基础上衍生出很多新技术，在动物检疫中逐渐被采用的PCR技术主要有多重PCR和荧光PCR技术。 　　 　　1　多重PCR技术 　　 　　多重PCR最先被用于疾病的诊断是1988年Chamber-lain将其应用于人的杜氏肌营养不良(DMD)基因外显子的检测。随后，在人医上被广泛应用于各种疾病的诊断。1993年，WirzB将其用于猪瘟病毒和其他瘟病毒属的鉴别诊断，从而拉开了在兽医诊断领域应用多重PCR的序幕。随后该技术不断的被报道用于动物细菌性、病毒性、寄生虫性疾病等的诊断，被公认为是一种方便、快速、敏感、特异的诊断方法。 　　 　　1.1　方法的特点 　　多重PCR是在常规PCR的基础上发展而来的。因此，其基本原理和常规PCR没有差别，所不同的是多重PCR技术是在同一个体系中加入多对引物，同时检测多个目标序列的存在。理论上讲，引物条数可以不加限制，但是实际操作中，由于随着引物条数的增加，引物之间的相互作用变得更为复杂，二聚体和错配的几率大大增加，优化各种条件变得更为困难，从而影响引物的扩增效果。虽然目前已有同时用9对引物扩增出相应目标片段的报道，但是实际工作中通常以使用引物不超过5对为好。在把单重PCR合并成多重PCR之前要进行不同扩增子之间引物的分析，条件进一步优化。 　　 　　1.2　方法的应用 　　多重PCR在动物中使用相当普遍，主要用于病原体强弱毒株的区分、鉴别诊断和分型鉴定等。 　　1.2.1　毒力强弱分析　新城疫是家禽的一种烈性传染病。但有时却表现出慢性疾病的特点，无典型的临床症状。因而需要一种不仅能够诊断该病而且能快速区别病原是强毒株还是弱毒株的方法。早期的研究多集中在RT-PCR扩增结合序列分析的方法上，虽然也不失为鉴别诊断新城疫的准确可靠的方法，但测序比较烦琐，成本也较高，难以进行大批量操作。20世纪80年代末到90年代初。新城疫基因组结构的阐明为建立这种鉴别诊断方法提供了可能。通过对大量不同毒力新城疫基因核苷酸序列的分析，根据强弱毒株FO裂解位点的序列差异设计合成了3对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录一聚合酶链式反应，该方法具有快速特异和操作简便的特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。 　　1.2.2　鉴别诊断　鸡传染性支气管炎(IB)、禽流感(AI)、鸡传染性喉气管炎(ILT)、鸡新城疫(ND)是严重危害鸡群的4种主要呼吸道传染病。这些传染病感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，曾给养鸡业造成沉痛的打击和巨大的经济损失。由于这些病原引起鸡表现相似的临床症状和病理剖解变化，用传统的临床诊断方法难以区别，并且这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐费时。根据4种传染病的各自保守序列设计4重PCR，由扩增后得到的特异性片段的大小来诊断是哪种疾病引起。 　　猪呼吸与繁殖综合征病毒(PRRSV)、典型猪瘟病毒(CS，FV)、圆环病毒(PCV)、细小病毒(PPV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV)和猪伪狂犬病毒(PRV)是引起猪繁殖障碍的常见病原，在临床上常呈混合感染。多重PCR技术用于PRRSV、CSFV、PCV、PPV和JEV感染的诊断能同时检测5种病毒的感染。 　　1.2.3　动物病原体的分型鉴定 猪链球菌分为35个荚膜血清型，1、2、1/2、7、9和14型从发病猪和死猪体内最常分离到的血清型。其中以2型致病性和毒力最强，其他血清型有的毒力偏弱、危害较少。有的甚至在临床上并不导致疾病。因此，在实践中。需要将2型猪链球菌与其他型分开。2型和1/2型猪链球菌的毒力基因cps基因中有几段是其他血清型猪链球菌没有的(cps2F、cps2H、cps2I和cps2J)。建立同时检测这些独有基因和共有基因的多重PCR就可以将2型、1/2型猪链球菌与其他型分开。 　　流感病毒的基因组极易发生变异，其中以编码血凝素(HA)的基因的突变率最高，其次为神经氨酸酶(NA)基因。迄今已知有16种HA和10