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PCR技术在畜禽传染病诊断中应用 　　PCR，即聚合酶链式反应,英文polymerase chain reaction的缩写，又称基因体外扩增技术，是在一对引物定向引导下，用DNA聚合酶对DNA中作为模板的特异性靶序列进行体外扩增的技术。PCR技术是美国马利斯（K.B.Mulli)）等在1985年提出的。它可以从极微量的生物材料中简便、快速地得到大量特定基因，或在众多复杂的生物基因中检测出单拷贝基因。 　　与传统的畜禽传染病诊断方法，如细菌学、病毒学、免疫学等方法相比，PCR技术快速方便、敏感性高、特异性强、操作简便。目前，PCR技术已在畜禽传染病诊断中发展得比较成熟，特别是在多种病毒性疾病的诊断中已相继得到应用，如猪蓝耳病、猪细小病毒病、伪狂犬病、猪圆环病毒病、口蹄疫、猪瘟、猪乙型脑炎、禽流感、鸡白血病、鸡新城疫等。 　　一、PCR技术基本原理 　　类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由“变性―退火―延伸”三个基本反应步骤构成： 　　1.模板DNA的变性 　　加热模板DNA至93℃左右一定时间后，其DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，成为单链，以便与引物结合，为下轮反应做准备。 　　2.模板DNA与引物的退火（复性） 　　模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。 　　3.引物的延伸：DNA模板 　　引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环“变性―退火―延伸”三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期（Plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 　　二、PCR技术的优缺点 　　1.PCR技术的优点 　　（１）灵敏度高。PCR产物的生成量以指数方式增加，能将皮克（pg=10-12）量级的起始待测模板扩增到微克（μg=10-6）水平，能从100万个细胞中检出一个靶细胞。在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。 　　（２）简便快速。PCR反应用耐高温的TaqDNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行“变性―退火―延伸”反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，电泳分析无放射性污染，易推广。 　　（３）对标本的纯度要求低。不需要分离病毒或细菌及培养细胞。DNA粗制品及RNA均可作为扩增模板，直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。 　　2.PCR技术的缺点 　　由于过高敏感性容易导致交叉扩增，当实验室污染后，可能出现假阳性结果，而在引物针对范围过窄或存在抑制剂情况下还会出现假阴性结果。 　　三、PCR技术在畜禽传染病诊断中的应用 　　1.诊断细菌性疾病 　　（１）猪呼吸道致病菌混合感染。胸膜肺炎放线杆菌、多杀性巴氏杆菌和副猪嗜血杆菌都是猪呼吸道常见的重要致病菌，都可能导致或者继发于其他病原感染。这三种细菌引起的临床症状很难区分，多重感染也给传统的细菌学诊断方法带来困难。PCR检测方法在检测临床样本时，尤其是当多种其他物种的DNA存在时，可能会出现非特异性扩增。当非特异性扩增产物的大小和预计阳性产物大小相似时，就可能发生误判，出现假阳性结果。为了对PCR产物进行定性，提高检测方法的特异性和敏感性，研究还建立了针对胸膜肺炎放线杆菌的PCR-ELISA检测方法。 　　（２）猪增生性肠炎。猪增生性肠炎是由胞内劳森氏菌引起的猪的接触性传染病。该菌可导致猪肠道功能严重损坏、腹泻、肠出血，而增厚的黏膜阻碍营养吸收，进而引起体重减轻，甚至造成死亡。PPE实验室诊断方法可以快速准确检测到含有45pg/μL的样品总DNA模板。PCR扩增能获得200bp特异性条带，与GenBank上公布的PHE/MN1-00株相应片段的核苷酸序列进行同源性分析，同源性若为99.50%，则表明扩增产物是特异性的目的片段。 　　此外，PCR技术还可用于副猪嗜血杆菌病、布鲁氏菌病、魏氏梭菌、猪链球菌等细菌性疾病的检测。 　　2.诊断病毒性疾病 　　（１）猪蓝耳病、猪细小病毒病、伪狂犬病、猪圆环病毒病。根椐GenBank中已发表的猪蓝耳病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、伪狂犬病毒（PRV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）等4种病毒基因序列，对各病毒基因区进行同源性分析，确定PRRSV M和N、PPV VP2、PRVgD、PCV-2ORF