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PCR和ELISA在食源性致病菌检测中应用 　　摘要 阐述了PCR和ELISA这两种技术在食源性致病菌检测中的研究，并对这两种方法特点与应用进行了探讨。 　　关键词 PCR；ELISA；致病菌检测 　　中图分类号 TS207.4文献标识码A文章编号1007-5739（2008）09-0182-03 　　 　　近几年，中国疾病预防控制中心营养与食品安全所对全国部分省市的生肉、熟肉、乳和乳制品、水产品、蔬菜中的致病菌污染状况进行了连续的动态监测，结果表明，微生物源性食物中毒占居首位，高达39．62％[1]。随着食品工业的发展以及对食品安全的重视，传统分析方法已经远不能满足食品检测的需要，迫切需要灵敏度更高、特异性更强、简便快捷的食品安全检测技术和方法。因此，近年来世界各国的许多机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究，改进和开发了一些快速的检测技术和方法。其中聚合酶链式反应（PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）以其简便、快速、灵敏、成本低、检测谱广等特点在食源性致病菌检测方面的应用也越来越受到人们的青睐。 　　 　　1PCR技术 　　 　　PCR技术即聚合酶链式反应，也称无细胞克隆系统，是1985年诞生的一项DNA体外扩增技术，该技术自问世以来，就以惊人的速度广泛地应用于生命科学的众多领域。目前在食品工程领域中致病微生物、转基因食品的检测等方面的应用也越来越受关注。 　　1.1PCR技术原理 　　PCR是在体外合适条件下，以单链DNA为模板，以1对人工合成的寡核苷酸为引物，在热稳定DNA聚合酶作用下特异性扩增DNA片段的技术。整个反应过程通常由20~40个PCR循环组成，每个PCR循环包括高温变性―低温复性―适温延伸3个步骤。方法是：首先将靶DNA双链加热变性为单链，然后加入2段人工合成的与靶DNA 两端邻近序列互补的寡核苷酸片段作为引物，即左端引物和右端引物；该对引物与互补的DNA单链碱基互补结合后，在有DNA聚合酶和4种dNTPs底物存在的情况下，引物沿模板DNA链（靶DNA单链）按5′末端向3′末端方向延伸，自动合成新的DNA双链，新合成的DNA双链又可作为扩增的模板，继续重复以上的DNA聚合酶反应。经过20～40次循环，可将靶DNA序列扩增近百万倍。 　　1.2PCR技术在食品致病菌检测中的应用 　　利用PCR检测食品中的致病菌，首先要富集细菌细胞，通常经离心沉淀、滤膜过滤等方法可从样品中获得细菌细胞，然后裂解细胞，使细胞中的DNA释放，纯化后经PCR扩增细胞靶DNA的特异性序列，最后用电泳法或特异性核酸探针检测扩增的DNA序列。 　　1.2.1单核细胞增生李斯特氏菌的检测。单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，LM）是食品卫生中的重要病原菌，多通过食品经口感染，被列为20世纪90年代食品中的四大病原菌之一。过去对食品中LM进行检测时，克隆培养的标准方法需要3～4周的时间才能得出结果。国外已广泛将PCR技术用于快速鉴定单核细胞增生李斯特菌，国内的报道也不少。杨百亮等（1994）通过条件优化，建立了快速检测牛奶中单核细胞增生李斯特菌的试剂盒[2]，并在同年报道了以l对位于该菌β-溶血素基因内的26bp寡核苷酸为引物，用PCR对市售猪肉和牛奶中的单核细胞增生李斯特菌的检测[3]。金大智等运用实时荧光PCR（Real-time PCR）技术建立对食品中单增李氏菌进行检测的快速方法，设计的引物和探针的序列特异性强，省去凝胶电泳的繁琐，降低了污染的可能性。对26种病原菌进行的检测结果表明，用实时荧光PCR法检测单核细胞增多李斯特氏菌，更快速、敏感，特异性更高。 　　1.2.2金黄色葡萄球菌的检测。金黄色葡萄球菌肠毒素（SE）可引起人类中毒，其内毒素――中毒休克综合症毒素（TssT1）可引起中毒休克综合症，产生的脱皮毒素（ETA、ETB）与一系列脓疱性葡萄球菌感染有关。金黄色葡萄球菌肠毒素是一种可溶性耐高热蛋白，根据血清型别不同，分为A、B、C、D和E等5个型。所有的金黄色葡萄球菌肠毒素都有一个相同的基本结构即含有二硫键和单一多肽链。其中肠毒素D（SED）的基因位于质粒上，由256个氨基酸残基组成，基因长为774个碱基对，已全部定位。目前金黄色葡萄球菌肠毒素D的鉴定主要是依赖于免疫学技术，该技术需要细菌纯培养和制备肠毒素，试验周期长、步骤繁多，使其在食品卫生学鉴定时受到限制，近年来PCR技术的发展为食品病原微生物的鉴定提供了新的途径。云泓若等（1999）选择SED基因的第360～381对碱基为上游引物，第654～675对碱基为下游引物，应用PCR技术扩增出SED基因的316bp长的DNA片段，并建立了直接利用细菌裂解液作为模板的PCR方法[4]。 　　1.2.3沙门