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PCR反应体系设计及优化 　　摘 要 PCR是分子生物学中常用的实验技术手段，在揭示生命现象规律方面发挥了至关重要的作用。目前在进行PCR实验操作时，因为PCR反应体系设计不合理而导致实验失败的事例较多。因此，从优化PCR反应体系的角度出发，对提高PCR反应效率进行探讨。 　　关键词 PCR；反应体系；实验 　　中图分类号：G642.423 文献标识码：B 　　文章编号：1671-489X（2016）02-0160-02 　　Abstract Polymerase Chain Reaction （PCR） technology is commonly 　　used in molecular biology experiments， which played a vital role in terms of reveals life phenomenon law. Now in the PCR laboratory procedures， more and more PCR experiment were failure examples because the not reasonable design PCR reaction system. Therefore， this article discussed the perspective of the PCR reaction system to improve the efficiency of the PCR reaction. 　　Key words Polymerase Chain Reaction； reaction system； experiment 　　1 标准PCR反应体系 　　标准的PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）反应体系由缓冲液、脱氧核苷三磷酸、DNA聚合酶、引物、DNA模板等构成[1]，每个部分在PCR反应中都有重要的作用，并且在合适的浓度范围内才能促进PCR反应的正常进行。 　　2 PCR反应体系设计 　　模板核酸 DNA模板是PCR反应复制的原始基础，模板质量的优劣，直接决定了整个PCR反应的成败。目前DNA提取方法主要有酚氯仿、高盐法及各试剂公司的试剂盒。酚氯仿作为传统经典的方法，一直受到科研工作者的青睐，其DNA提取质量与纯度较高，但是缺点是程序繁琐、提取效率低。目前在一些样品比较大的实验中，主要采用高盐法提取DNA。试剂盒提取DNA效率与质量都较好，但是费用较高。在PCR反应体系中，一般加入模板的质量为50～100 ng，加入模板的量过多，或产生较多的杂质，出现很多非特异性产物；如果加入的模板较少，产生的特异性产物较少，在检测过程中不易检测。 　　DNA聚合酶 DNA聚合酶是PCR反应中将游离的散乱的碱基按照模板中碱基的顺序，连接于DNA双链中的粘合剂。目前DNA聚合酶主要有两种类型：一种是从水生杆菌中提取的天然聚合酶；另一种是利用大肠杆菌人工合成的基因工程酶。由于当前分子生物学的迅速发展，人工合成的基因工程酶越来越多地得到应用，在20 μl PCR反应体系中，所需要的DNA聚合酶一般为2.5个单位。加入的NDA聚合酶过多，会引起很多非特异性扩增，产生没有用途的非特异性产物；相反，如果加入的DNA酶过少，则会减少特异性产物的产量。 　　脱氧核苷三磷酸（dNTP） dNTP是合成DNA的原料，主要是4种碱基。dNTP是以干粉状态保存的，在进行分子实验时，需要利用缓冲液溶液和调节pH值，并且小量分装，保存在-20 ℃冰箱中。尽量减少反复冻融的次数，在PCR反应中dNTP的浓度一般在50～200 μmol/L范围内。注意4种dNTP的浓度要相等，如果任何一种dNTP的浓度过低，产生错配的几率将会大大增大；如果dNTP的整体浓度过低，则会降低PCR反应中特异性产物的量；如果dNTP量过高，则会与Mg2+结合，降低Mg2+的浓度。 　　引物 引物中碱基与模板DNA互补的程度，决定了PCR产物的特异性，这也是PCR特异性扩增反应的关键环节。在设计引物序列时，一般遵循以下几个原则： 　　1）引物的长度一般在15～30 bp之间，20 bp为最优，过短或者过长都不利于PCR的特异性反应； 　　2）引物的扩增跨度在200～500 bp为好，在特定情况下也可以将扩增片段增至10 kbp； 　　3）引物的4种碱基中，3′端含有G或者C可以提高引物的特异性，G、C的含量在40%～60%为好，太少或者太多都不利于扩增； 　　4）引物之间要避免碱基的互补，否则会出现发夹结构，这种二级结构阻止引物与模板的复性结合；特别要注意的是，引物之间不能有连续4个以上的碱基互补，否则产生的非特异性扩