PCR及RTPCR对咽拭子标本肺炎支原体检测探究.docVIP

PCR及RTPCR对咽拭子标本肺炎支原体检测探究 　　摘要：目的分析PCR及RT-PCR对咽拭子标本肺炎支原体的检测结果。方法收集2013年01月~2014年01月本院收治的140例儿科门诊患儿临床资料，其中肺炎支原体患儿68例，疑似肺炎支原体患儿72例，分别采取PCR及RT-PCR方法检测，最后分析两种检测方法的应用价值。结果140例患儿咽拭子标本中共检测阳性标本18例(12.85%)，共检测出阳性52例，占37.14%；阴性88例，占62.86%。RT-PCR测定咽拭子标本肺炎支原体的敏感度明显高于PCR检测，差异显著，具有统计学意义(P0.05)。在140例儿科门诊患儿中，≤３岁组儿童呼吸道感染阳性率为57.86%，明显高于≤7岁组患儿、7岁组患儿的30.71%、11.43%，差异显著，具有统计学意义(P0.05)。结论与PCR检测方法对比，采取RT-PCR检测咽拭子标本肺炎支原体，可提高早期临床诊断的准确性，合理判断临床治疗效果。 　　关键词：PCR；RT-PCR；咽拭子；肺炎支原体肺炎支原体(ＭP)作为呼吸感染性临床疾病中一种常见的病原体，可通过呼吸道传播原发性非典型肺炎，此疾病发病时期为秋冬季节，发病对象大部分为婴幼儿，患儿临床症状表现为：持续发热、咳嗽咳痰等[1]。肺炎支原体诊断大多是通过实验室的检查，临床诊断与流行病学调查作为主要的临床检测手段，但在临床检测过程中容易受到患儿年龄、病程、机体免疫系统等因素的影响[2]。因此，需要进行双份血清检测，才能明确区分近期Mp急性感染。但是，在临床检测中难以获取双份血清，因此，单份血清抗体检测只能作为ＭP感染的诊断辅助手段。随着分子生物学诊断方法的改进，PCR检测方法在ＭP感染早期临床诊断中得到广泛的应用，在20世纪初出现了一种荧光实时定量PCRRT-PCR，此检测方法加入了特异性较强的探针，在PCR检测过程中明确大量致病菌的定位。为了分析PCR及RT-PCR对咽拭子标本肺炎支原体的检测结果，本院采取PCR及RT-PCR方法进行检测咽拭子标本肺炎支原体，现将结果报道如下。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料收集2013年01月~2014年01月本院收治的140例儿科门诊患儿临床资料，其中肺炎支原体患儿68例，疑似肺炎支原体患儿72例，其中男性83例，女性57例，年龄1个月~12岁，平均年龄为(3.55±1.33)岁。 　　1.2方法 　　1.2.1标本收集与处理所有患儿均取咽拭子，放置在1.5mlEP管中进行搅拌，弃拭子。进行离心1min，10000r/min,去上清，采取细菌基因组ＤＮＡ提取试剂盒，取500ul样本提取DNA，取上清液２Ｌ作为模板。同时，应用PCR、Rt-PCR检测方法，将75.00ｇKH２PO４0.52ｇ，Na２HPO４1.22g，Ｌ－谷氨酸(glu)0.72gr溶于800ml去离子水中，将PH值调整到7.4，定容到1Ｌ，采取0.2m滤器抽滤除菌分装，放置在低温下保存。 　　1.2.2研究方法PCR参照文献合成Mp16SrRNA基因扩增引物[3]，终止反应后，1u6×溴酚蓝加样缓冲液加入到5LPCR扩增产物样品中，在1.5％的琼脂糖凝胶中电泳紫外灯下观察结果。Rt－PCR试剂盒应总体积为50ul，完成反应后，电脑自动采集于分析结果。 　　1.3诊断标准①治诊标准：呼吸道症状和或体征Ｘ线胸片不同程度的肺部炎症表现，单份血清Mp－IgM阳性，大环内酯类抗生素治疗显效。②PCR诊断标准：PCR的扩增产物为277bp，与阳性对照有相同条带为Mp感染阳性。③Rt-PCRR诊断标准：患儿咽拭子的ＤNA拷贝数1.00e+005coeiesml诊断为Mp感染阳性。 　　1.4统计学处理本次研究资料均采用SPSS18.0统计学软件处理，计数资料对比采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　2.1 PCR检测经紫外灯观察，琼脂糖凝胶上形成目标片段，其大小约为277bp，即可判断为阳性。140例患儿咽拭子标本中共检测阳性标本18例，占12.85%。 　　2.2 RT-PCR检测 140例标本共检测出阳性52例，占37.14%；阴性88例，占62.86%。 　　2.3对比PCR及RT-PCR测定咽拭子标本肺炎支原体的敏感度、特异度RT-PCR测定咽拭子标本肺炎支原体的敏感度为88.24%，明显高于PCR检测的8.82%；差异显著，具有统计学意义(P0.05)，见表1。 　　 　　 　　 　　 　　 　　2.4 Mp感染阳性患儿不同年龄段分布结果分析在140例儿科门诊患儿中，≤３岁组儿童呼吸道感染81例(57.86%)，≤7岁组患儿感染43例(30.71%)，7岁组患儿感染16例(11.43%)，各个年龄阶段阳性