HPLC―ICPMS测定硒蛋白中硒代氨基酸方法.docVIP

HPLC―ICPMS测定硒蛋白中硒代氨基酸方法 　　【摘 要】建立一种适用于检测硒蛋白中硒代氨基酸的方法，使其应用于食品中营养强化剂硒蛋白的检测。用酶解硒蛋白；5mM 的柠檬酸铵加2%的甲醇溶液作为流动相，离子交换柱分离硒代氨基酸；ICP/MS检测硒代氨基酸的含量。用蛋白酶K、胰蛋白酶、链蛋白酶酶解，并用柠檬酸调节流动相的 pH 值（pH=4.9）能够成功分离SeCys、SeMet等硒代氨基酸。检出限分别为：3.5μg/kg、11.2μg/kg；线性范围为：以Se计为0～200μg/L；加标回收率为：75%～120%。该方法能适用于硒蛋白中硒代氨基酸的分析。 　　【关键词】含硒蛋白；硒代氨基酸；离子交换；HPLC-ICP/MS 　　【文章编号】1004-7484（2014）07-4586-02 　　【Abstract】To establish a method for detection of selenium in selenium amino acid generation， detection and it can be used in food nutrition fortifier of selenoproteins. Solution of selenoprotein enzymes； 5mM methanol solution and ammonium citrate plus 2% as the mobile phase， ion exchange column chromatography of seleno amino acids； content of ICP/MS detection of seleno amino acids. Using proteinase K， trypsin， pronase enzyme solution with citric acid， and adjusting the pH value of the mobile phase （pH=4.9） to SeCys， SeMet seleno amino acid separation. The detection limits were：； the linear range is： Se 0～200 μ g/L； recovery of standard addition： 75%～120%. Analysis of the method can be used in generation of selenoproteins in amino acid. 　　【Key words】Selenium； Seleno amino acids； Ion exchange；HPLC-ICP/MS 　　1 引言 　　硒是一种人体必需的微量元素，以硒酶、 硒蛋白的形式广泛存在于生物体内，其中含有硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸残基的蛋白质为硒蛋白[1]。硒半胱氨酸是承载硒元素最主要的方式，硒半胱氨酸也因其重要性被称作第21个氨基酸，在哺乳动物体内参与蛋白组成，所以这种情况下硒蛋白也就是含有硒半胱氨酸的蛋白。此外，硒以硒甲硫氨酸或硒蛋氨酸为主要结合态存在于粮食中。虽然硒甲硫氨酸参入蛋白质合成可能是随机过程，但是含有硒甲硫氨酸的蛋白也称为硒蛋白。越来越多的证据显示植物硒蛋白中含有硒蛋氨酸和硒代半胱氨酸[2]。最近，王卫真等[3，4]从大蒜中初步分离出硒蛋白，纸色谱证实蛋白中含有硒蛋氨酸和硒半胱氨酸。 　　国外已有数篇文章综述了硒形态分析的相关方法[5，6]，联用技术被认为是进行化学形态分析（chemical speciation）的有效手段，其中高效液相色谱（HPLC）与电感耦合等离子质谱（ICP/MS）联用作为一种高灵敏的元素形态分析方法得到广泛的应用[7～10]。本研究建立了分离和分析硒蛋白的HPLC-ICP/MS联用的方法，并成功地应用于不同类型实际样品硒蛋白中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的研究。 　　由于硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸为敏感氨基酸，其中半胱氨酸残基的侧链琉基不稳定；蛋氨酸的含量往往较低，且用HCL水解时特别是有碳氢化合物存在时很容易遭到破坏，所以测定不能用普通的水解方法进行[11]。本研究采用中性蛋白酶酶解，中性蛋白酶是由枯草芽孢杆菌经发酵提取而得的，属于一种内切酶，可用于各种蛋白质水解处理。在一定温度、PH值下，本类酶能将大分子蛋白质水解为氨基酸等产物。可广泛应用于动植物蛋白的水解，制取生产高级调味品和食品营养强化剂的HAP和HVP。 　　离子交换色谱包括阴离子交换色谱和阳离子交换色谱，不仅可以分离无机离子，而且可以分离任何易解离的物质[12]。阴离子和阳离子交换色谱都成功的应用于分析生物样品中的硒形态[1