不同分子量段蛹虫草多糖超滤分离及其对巨噬细胞释放NO影响.docVIP

不同分子量段蛹虫草多糖的超滤分离及其对巨噬细胞释放NO的影响 　　摘要：用超滤法将蛹虫草（??Cordyceps militaris??）子实体水提物分为750 kDa（PW5）5个部分，并测定了这5部分的总糖含量、单糖组成及其对巨噬细胞释放NO产量的影响。结果表明，蛹虫草粗提物总得率（PW1~PW5之和）为38.35%，其中PW1得率最高（36.482%），其次是PW2（1.822%），PW3～PW5的得率都很低；各部分的总糖含量都较高（45.70%～60.48%）。单糖组成分析表明，各部分的多糖分别由3～6种单糖组成，其中甘露糖、葡萄糖、半乳糖为主要单糖。PW2～PW5均具有刺激巨噬细胞释放NO的活性，且随着浓度的增加活性增强。?? 　　关键词：蛹虫草； 超虑分离； 分子量； NO产量； 巨噬细胞 　　 　　 　　蛹虫草（??Cordyceps militaris??）又名北冬虫夏草，是一种最常见的药用价值极高的虫草菌，由于近年来大规模栽培的成功，越来越多地被用于医疗保健中［1］。蛹虫草子实体含有核苷类、多糖类、虫草酸、甾醇类等多种成分，其中虫草多糖具有免疫调节、抗肿瘤和抗衰老等多种活性［2］。多糖的生理活性与其结构、分子量大小等密切相关，而提取方法直接影响到多糖药用价值的开发和利用［3］。超滤是一种新型膜分离技术，利用不同的孔径截留不同分子量物质，具有常温操作、无相态变化，可以防止杂菌污染和热敏性物质失活等特点，近年来越来越多地被用于真菌多糖的提取、分离和纯化［3，4］。因此，笔者利用膜超滤法对蛹虫草子实体水提物进行分离，并考察不同分子量段粗多糖的单糖组成及对巨噬细胞释放NO产量的影响，为阐明蛹虫草多糖的生物活性及分子量之间关系提供参考。?? 　　1 材料与方法 　　1.1?Σ牧嫌胧约? 　　 蛹虫草（??C. militar??is）子实体干品由张家港东方神草生物科技有限公司提供。标本存放于上海市农业科学院食用菌研究所药用真菌研究室。RAW264.7巨噬细胞株由中国科学院细胞所提供。?? 　　RPMI1640培养基、DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）为Gibco公司产品；青霉素和链霉素购自Amresco公司；细菌脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）为Sigma公司产品；三氟乙酸为Merck公司产品；其它试剂均为国产分析纯。?? 　　1.2?Ψ椒? 　　1.2.1?Σ煌?分子量段蛹虫草多糖的制备 　　 蛹虫草子实体(2.5 kg)于蒸馏水中浸泡（料水质量比为1∶10）2 h，100 ℃提取2 h，过滤后滤渣重复上述操作1次，合并2次提取液，分别上分子截留量为750 kDa、300 kDa、100 kDa和??10 kDa??的超虑系统（Quixstand????TM??, Amersham Biosciences），将粗提物按分子量大小分为??750 kDa??（PW5）5部分，每部分加热浓缩体积至??5 L??左右，冷冻干燥，称重，计算得率。?? 　　1.2.2?ψ芴呛?量测定 　　 采用苯酚-硫酸法测定PW1～PW5中的总糖含量［5］。?? 　　1.2.3?Φヌ亲槌刹舛? 　　 参考文献［6］的方法测定PW1～PW5的单糖组成。?? 　　1.2.4??巨噬细胞释放NO产量的测定 　　 在无菌条件下将PW1~PW5用PBS（含??0.14 mol/L?? NaCl, 0.0027 mol/L KCl, ??0.004 mol/L?? Na????2??HPO????4??, 0.002 mol/L KH????2??PO????4??, pH7.4）溶解并稀释成0.1、0.5和??2.0 mg/mL??的溶液（作用终浓度为10、50、??200 μg/L??），参考文献［7］的方法测定巨噬细胞释放NO的产量。?? 　　2 结果与分析 　　2.1?Σ煌?分子量段粗提物得率及其总糖含量和单糖组成 　　 蛹虫草粗提物的总得率（PW1~PW5之和）较高，为38.35%，但其中95%为小于10 kDa的部分。分子量为10~100 kDa（PW2）部分得率为1.82%，多糖含量为43.70%，这部分含有较高比例的岩藻糖和鼠李糖。分子量大于100 kDa（PW3~PW5）的部分在蛹虫草中的含量极低，仅为0.05%，单糖组成也较类似，主要由甘露糖、葡萄糖和半乳糖组成（表1）。?? 　　2.2?Σ煌?分子量段粗提物对体外刺激巨噬细胞释放NO产量的影响 　　 体外刺激巨噬细胞释放NO的实验结果表明，PW1没有活性，PW2～PW5都有良好的体外刺激巨噬细胞释放NO的活性，且在试验浓度范围内，活性随着剂量的增加而增强，其中PW3