中药质量标准价分子免疫学研究.docVIP

中药质量标准价的分子免疫学研究 　　摘要：中药的质量标准研究除少量采用形态法(包括显微)外，一般均用现代理化分析方法。直到1995年版药典，中药质量标准尚未有分子生物学理论和方法的应用，这与当今分子生物学的发展是极不相称的，也不利于中药自身发展及指导临床。应当以中药品种分子遗传特征进行中药质量标准研究的新思路。 　　主题词：中药质量标准 分子免疫学 研究 　　 　　一、免疫学研究特点 　　 　　大多数植物的初级或次级代谢产物，因其专属性强，又可与化学对照品比较测定，常作为中药质量标准或指标性成分。但是单一化学成分所携信息量有限，不同亲缘种，亚种间常含相同成分，例如黄柏与黄连均含小檗碱。同一品种在环境因素作用下也可能含不同质和量的化学成分。至于动物类中药，由于缺乏特异的次级代谢产物，更难以某种“化学成分”进行专属鉴别。分子生物学研究决定遗传特征的信息大分子，包括DNA、RNA及蛋白质，故可针对中药的物种进行鉴别和质量评价。以分子遗传标记进行中药鉴别，由于可以区别亲缘关系的种、亚种甚至居群，对环境因素有较大保守性，将会对中药的分类学、药剂学及质量标准研究产生极其深刻的影响。我们认为以中药物种遗传特征作质量标准或者作理化分析的补充，有利于保护地道药材，有利于临床根据中医理论用药，也有利于市场防伪。由于国外容易接受药材种属遗传特征的质量观念，反而不理解诸如小檗碱作为天然黄连质量标志的习惯，所以也还有利于出口准入。对于动物类中药，甚至可能成为解决专属鉴定的基本方法。 　　 　　二、免疫学研究现状 　　 　　1、传统蛋白质分析 早在20多年前即有人提出以种属蛋白特征进行中药鉴别思路，先后报道氨基酸含量、电泳、同工酶及免疫血清等，至今仍在继续。主要问题是不规范，难以重复。鉴于部分中药材及制剂中蛋白已有不同程度的水解，故近年发展的X衍射、核磁共振、质谱、HP以及毛细管电泳等测定蛋白质的新技术，均难以直接用于质量标准。一般免疫化学法采用全价抗原分析，却不能用于亲缘接近的品种鉴别。 　　2、DNA分子标记DNA作为遗传信息的直接载体，不受环境因素、个体发育阶段及组织部位影响。而且DNA化学稳定性高，在一般贮存条件下不易降解，所以近年DNA分子标记鉴别发展很快。从1994年香港中文大学首次报告随机引物多聚酶反应(AP-PCR或RAPD)鉴别人参和西洋参以来，鉴别的中药已达30～40个品种，有的甚至申请了专利。但是目前DNA鉴别仍限于中药材的分析，对于多种中药组成的复方制剂，随机多态分析技术不适用于混合模板。建议加快建立重要中药材基因库，寻找出品种高度保守的特异DNA序列，合成专属的引物，才能真正应用于中药制剂的质量标准研究。 　　3、蛋白质分子免疫标记从海王“金牡蛎胶囊生化免疫鉴别及含量测定研究”项目中，提出了一个不同于传统蛋白质分析的思路。其核心是确证55KD多肽是牡蛎种属特征蛋白(抗原)，纯化并制定该蛋白质的质控条件，制成免疫学对照品。然后免疫动物制备抗体作为检测药盒。采用不同方法可在10-3g及10-9g范围与其他贝类鉴别。其线性、精密度、重现性和稳定性及回收试验等方法学考察，均接近理化分析要求。实际上已用于企业内部质量标准，其后证明用此方法可检出健民“龙牡壮骨冲剂”中极微量的牡蛎蛋白。 　　 　　三、主要步骤及关键技术 　　 　　1、免疫学对照品的设立和质控 　　1）中药材种属特征蛋白的确证:能否取得含量丰富、抗原性强，既是药典规定入药的各亚种间共同蛋白，又不与其他类似品种交叉的特征多肽(抗原)，是整个质量研究成败的关键和难点。除经典的电泳分析(SDS、Native、IEF、2D电泳、糖蛋白电泳)外，推荐“免疫吸收印迹电泳”技术。即先将药材提取蛋白质，免疫动物制备全价抗血清，逐一加入待鉴别品种“吸收”血清中交叉的抗体，然后用吸收后血清作一抗进行免疫印迹(westernblot)，未被吸收的组分极可能具特异性。再结合分子量，等电点及排除糖蛋白、脂蛋白后，可确定为该种属特征蛋白。 　　2）种属特征蛋白纯化及多克隆抗体制备:目的是对初步确证的蛋白质作进一步考察。如果仅作市场防伪或企业内部质控，提取的蛋白质只要分子量明确，SDS基本上一条带，交叉免疫单一峰，再测定蛋白质含量，即可作为粗对照品。以此免疫家兔，测定抗体滴度大于1/64，制备IgG酶结合物，已可满足应用的要求。特征蛋白纯化可从SDS直接制备，但多数情况下仍使用盐析(分子筛)或凝胶过滤(离子交换方法)制备。 　　3）种属特征短肽序列分析:天然纯化的蛋白质分子量仍较大，性质不均一，其质量受提取方法影响很大，与化学对照品技术要求距离较大。我们认为，用于中药新药质量标准的免疫学对照品，应当具有氨基酸序列清楚、抗原性专一、稳定性强及便于制取供应等条件，只有简