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亚低温对脑梗死后AQP4及MMP9表达的影响 　　摘要:目的。观察脑梗死后亚低温干预对大鼠水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)及基质金属蛋白酶-9 (matrix metallop roteinase-9,MMP-9)表达的影响,探讨亚低温对缺血性脑水肿的作用机制。方法。线栓法制造大鼠局灶性脑缺血模型,同时给予亚低温治疗。用免疫组织化学方法检测AQP4和MMP9的表达。用干湿重法检测脑水含量。结果。再灌注损伤后脑内AQP4蛋白水平迅速降低,至再灌注后12h达最低水平,至再灌注7d时接近正常水平。MMP9于再灌注损伤后表达明显增强,至再灌注后72h达高峰,以后逐渐下降, 至再灌注7d时仍高于正常水平。亚低温组AQP4、MMP9表达及脑水含量均明显低于常温组。结论。亚低温能明显减轻脑缺血AQP4及MMP9的表达 ,亚低温可能通过抑制AQP4及MMP9的表达而减轻脑水肿。 　　关键词: 亚低温;水通道蛋白4;基质金属蛋白酶-9;血脑屏障 　　 　　研究[1]表明亚低温具有显著的脑保护作用,对于急性脑血管病引发的脑水肿具有明显的抑制作用。AQP是近年来发现的一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白,是影响水跨膜转运和细胞内外环境平衡调节的主要膜蛋白,而脑组织中主要为水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4),可能参与多种神经系统疾病中脑水肿的形成。研究[2]发现基质金属蛋白酶-9 (matrix metallop roteinase-9,MMP-9)在脑缺血后脑水肿形成中可能起了重要作用,本实验主要研究亚低温对AQP4及MMP9表达的影响及其改善缺血性脑水肿的作用,进一步探讨亚低温脑保护的作用机制。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　雄性SD大鼠104只,体质量220～250g,由哈尔滨医科大学附属第二临床医院实验动物中心提供。将大鼠随机分为免疫组化组(52只)和脑水含量组(52只),每组再随机分为假手术组(4只)、常温缺血组(24只)和亚低温缺血组(24只),其中两缺血组根据再灌注时间不同又分为再灌注3h,6h,12h,24h,72h和7d6个小组,每小组4只大鼠。 　　1.2 方法 　　采用改良的Longa线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型,假手术组手术步骤相同,但不插入栓线。参照Longa等确立的5级评分法。1～4分为有效模型,纳入实验。 　　1.3 处理 　　亚低温组于缺血30min时实施病灶侧局部亚低温,脑温控制在32℃～35℃,持续4h。免疫组化组在相应时间点经甲醛溶液心脏灌流固定后断头取脑。脑水含量组不经甲醛灌流,直接断头取脑。 　　1.4 免疫组化染色 　　二步法参照试剂说明书进行。一抗兔抗鼠AQP4多克隆抗体及兔抗大鼠MMP9SABC试剂盒购自武汉博士德公司。胞浆或胞核出现棕黄色颗粒为染色阳性。在每张切片梗死灶周围半暗带选择10个表达最强的高倍视野计阳性细胞数。 　　1.5 脑水含量测定 　　大鼠相应时间点断头取脑,用电子秤称量全脑湿重,然后将全脑置于110℃烤箱,24h后称量干重。根据公式:脑水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。以每100g湿重脑组织中所含水的质量(g)来表示。 　　1.6 统计学分析 　　采用SPSS10.0统计软件处理,两样本t检验进行统计分析,结果用x±s表示。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 AQP4和MMP9表达 　　免疫组化染色结果显示AQP4在缺血再灌注后,表达水平迅速降低,12h达最低水平,再灌注24h时开始恢复,至再灌注7d时接近正常水平,但仍低于正常水平。亚低温各时间点表达明显少于常温组(P〈0.05, 附表)。MMP9随着再灌注时间的延长其表达明显增强,72h达高峰,以后逐渐下降, 7d时仍高于假手术组。亚低温组各时间点表达明显少于常温组(p〈0.05,附表) 　　2.2 脑组织含水量在缺血再灌注损伤后3h开始增加(P 0.05) , 12h明显增加, 24～72h达高峰( P 0.05) ,此后渐下降, 7d时基本恢复正常水平。亚低温组脑水含量明显低于常温组。假手术组脑水含量无明显变化。(附表) 　　 　　3 讨论 　　 　　脑水肿是脑缺血后的基本病理变化之一,与脑缺血死亡率密切相关。目前越来越多的证据显示脑缺血后脑水肿与水通道蛋白-4(AQP4)有密切关系。AQP4是水通道蛋白(aquaporins,AQPs)家族中的一员,是中枢神经系统中主要的水通道蛋白,主要表达于星形胶质细胞、也表达于软脑膜、脑实质的血管周围、脑室和室管膜、脉络丛等与脑脊液(CSF)直接接触的组织中。MMP9是一种重要的细胞外基质( ECM)降解酶,可降解基底膜的ECM成分,主要由炎性细胞如T细胞、中