低氧对小鼠成纤维细胞L929瘦素及其受体mRNA表达影响.docVIP

低氧对小鼠成纤维细胞L929瘦素及其受体mRNA表达的影响 　　摘要：目的 检测低氧条件下小鼠成纤维细胞L929中瘦素及其受体的mRNA表达。方法 L929细胞在常氧和1%O2浓度下分别诱导6h、12h和24h后收集细胞，提取总RNA，以RT-qPCR方法检测瘦素及瘦素受体mRNA的表达水平。结果 与常氧对照组相比，瘦素在低氧分别诱导6h、12h和24h后的表达倍数分别为（1.46±0.10）、（1.24±0.05）和（1.25±0.06），差异有统计学意义（P0.05）。瘦素受体的表达倍数为（1.42±0.07）、（2.23±0.22）和（3.11±0.14），差异有统计学意义（P0.05）。结论 低氧能够影响小鼠成纤维细胞L929瘦素及受体表达变化。1%O2浓度下瘦素的表达升高，但随时间增加升高强度减弱，瘦素受体的表达依次升高。 　　关键词：瘦素；瘦素受体；低氧；小鼠成纤维细胞 　　低氧（hypoxia）是临床各种疾病中极常见的一类病理过程，低氧可以导致成纤维细胞增殖引起纤维化[1]。瘦素在纤维化的形成中有一定作用，但是低氧条件下成纤维细胞与瘦素和其受体的关系研究较少，本课题采用物理低氧方法，研究体外培养的小鼠成纤维细胞L929在低氧条件下是否表达瘦素（Leptin）和瘦素受体（Leptin receptor，Lepr）以及其mRNA表达变化规律，旨在为低氧引起的纤维化的发病机制的研究和临床治疗提供启示。 　　1 资料与方法 　　1.1细胞及分组 L929细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，在37℃，5%CO2培养箱中培养。本研究共设3个低氧诱导时间点：6h、12h和24h。每个时间点的细胞分成常氧组（21%O2）和低氧组（1%O2）。每组3个平行样本，实验重复3次。 　　1.2主要试剂 ①TRizol和SYBR Green试剂盒由Life公司提供；②mRNA反转录试剂盒，由TaKaRa公司提供；③Leptin、Lepr和actin引物由上海生工合成，引物序列见表1。 　　1.3方法 　　1.3.1低氧诱导及样本收集 细胞接种至12孔板，贴壁生长良好后，将3组细胞放入Billups-rothenberg缺氧培养小室（MIC-101）[2]，充入低氧气体保证低氧小室O2浓度为1%，具体方法如下：低氧小室充入95%N2+5%CO2组合的低氧混合气体，气流控制在35～40L/min，输入气体35min，关闭气阀。充气完毕后将低氧小室放入CO2培养箱，同时将常氧组细胞放入培养箱，记为低氧诱导开始。分别培养6h、12h和24h后取出低氧组和对照组细胞。经PBS洗3次后加入TRizol 0.5ml，冰上裂解5min后用移液枪吹打收集细胞至干净无菌的1.5ml离心管。 　　1.3.2总RNA提取和mRNA逆转录 TRizol提取总RNA的方法参见文献[3]。提取完成后各样本取1μl至Nanodrop核酸浓度检测仪检测浓度和纯度。mRNA逆转录参见TaKaRa试剂盒说明，反转录后cDNA样本用超纯水稀释5倍后待用。 　　1.3.3 Real-time PCR定量 用罗氏LightCycle实时定量PCR仪分析，反应体系为20μl：2× SYBR Select Master Mix，10μl；正反向引物各0.8μl ；cDNA，5μl。采用2步法扩增，具体程序：预变性，50℃，2min；95℃，2min。扩增，95℃，15s，60℃，1min，40cycles。熔解曲线，95℃，10s，65℃，1min，97℃，1s，1cycle。降温，37℃，30s。结果采用2-△△CT法分析[6]。 　　1.4统计学方法 应用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析。计量数据以（x±s）表示，组间两两比较采用配对t检验。P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1总RNA浓度和纯度 各样本总RNA提取后检测，所有样本OD260/280在1.8～2.0，浓度在150～300ng/μl，说明样本提取合格，可用于本研究后续实验。 　　2.2低氧诱导后瘦素表达 对低氧和常氧组在6h、12h和24h三个时间点的cDNA样本进行RT-qPCR实验，结果显示L929细胞在常氧和低氧下均能表达瘦素和瘦素受体基因。与对应的常氧组相比，Leptin mRNA表达升高，但是随诱导时间增加趋势减弱，其中6h组：（1.46±0.10）；12h组：（1.24±0.05）；24h组：（1.25±0.06），差异均有统计学意义（P0.05），结果见图1。 　　图1 不同低氧诱导时间下瘦素mRNA的表达较常氧组倍数变化 　　2.3低氧诱导后瘦素受体的表达 与常氧浓度组相比，瘦素受体表达倍数差异随低氧诱导时间增加依次升高，其中6h组：