同位素稀释―激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱法测定生物组织样品中铁元素的含量.docVIP

同位素稀释―激光剥蚀―电感耦合等离子体质谱法测定生物组织样品中铁元素的含量 　　摘要：针对目前采用同位素稀释激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（IDLAICPMS）对固体生物组织切片样品难以实现原位准确定量的难题，本研究将同位素稀释法与LAICPMS技术相结合，通过开展生物组织样品与浓缩稀释剂的同位素充分交换平衡、稀释剂添加方式、原位的同位素比测量等关键技术研究，确定了组织切片与同位素稀释剂的最佳平衡时间、稀释剂的质量以及选用甲醇作为稀释剂溶剂等实验条件，建立了基于同位素稀释技术的LAICPMS技术在生物样品组织切片中Fe元素的微区定量分析方法，并采用实验室自行制备的均匀的山羊脑和牛肝组织切片标准样品对方法进行了验证，通过IDLAICPMS方法的测量结果与微波消解同位素稀释方法的测量结果相一致，验证了该方法的有效性和可靠性。本方法可进一步应用于临床中生物组织切片样品中金属元素的原位、微区定量测量及成像分析。 　　关键词：同位素稀释； 激光剥蚀电感耦合等离子体质谱； 原位微区定量； 组织切片 　　1引言 　　激光剥蚀电感耦合等离子体质谱（LAICPMS）是在质谱检测的基础上结合激光剥蚀进样技术而成的一种固体微区分析新技术[1]。该技术固体进样前处理相对简单，引入等离子体的干气溶胶较湿法进样干扰少，且其原位（insitu）、微区、快速的分析优势，以及灵敏度高、检出限低、空间分辨率小于10 μm、可进行多种元素含量和同位素组成测量的能力成为已成为生物医学研究中一种很有潜力的分析方法，近年来已成为质谱分析技术应用的前沿。在生物临床领域中的应用报道中，研究对象涉及植物[2～4]、动物脑[5～8]和其它生物组织切片[9～13]样品等。然而，LAICPMS技术在生物临床领域的应用中，由于目前与待测样品基体相匹配的标准物质或标准样品还相当匮乏，而该技术本身受样品基体效应、分馏效应、质量歧视等是影响又十分严重，导致LAICPMS在准确定量分析方面存在较大困难[14]。目前，LAICPMS应用研究多集中于元素含量的相对测量，即用相对计数表示含量，不能给出绝对量值，难以满足生物医学研究中对生物组织样品原位、微区元素分布准确定量分析的要求。 　　同位素稀释质谱法（IDMS）是国际公认的高准确度分析方法之一，如能将灵敏、准确的同位素稀释技术与可以实现原位、微区分析的LAICPMS结合，将为解决LAICPMS进行生物样品原位微区准确定量元素测量提供一条理想途径。目前，基于IDMS技术LAICPMS定量方法研究，主要包括两种方案：（1）固体稀释剂标记技术（Solidspiking for direct analysis）。通过采用溶液稀释剂与固体样品混合、均匀化、干燥等步骤，使稀释剂与固体样品中待测元素发生同位素交换，制备出可用于标记待测固体样品的固体稀释剂，该固体稀释剂可以与待测样品混合、均匀、压片后，用于LAICPMS测量的样品[15～17]。该方法由于采用了IDMS技术，使得LAICPMS定量分析准确度有所提高，减小了测量不确定度，然而却不能应用于组织切片的原位、微区分析。（2）溶液稀释剂在线引入技术[18～20]。即通过溶液稀释剂在线引入到激光剥蚀样品池，在池中与剥蚀固体样品产生的气溶胶混合并发生同位素交换，混合气溶胶引入到ICPMS中进行测量。这种方式制样过程相对简单，适用性较强，没有样品与稀释剂混合、均匀化的过程，因此可应用于组织切片样品的原位、微区定量分析。然而，此方法在应用中还存在两个技术难点：一是如何确定与待测样品发生反应的稀释剂质量；二是如何确定稀释剂与样品之间的同位素交换是否达到平衡。目前，将IDMS方法与LAICPMS相结合，用于组织切片样品的原位、微区绝对定量分析尚未见报道。 　　本研究基于同位素稀释法与LAICPMS相结合的技术，开展了生物组织样品与浓缩稀释剂的同位素充分交换平衡、稀释剂添加方式、原位的同位素比测量等关键技术的探索性研究，建立了同位素稀释LAICPMS技术在生物样品组织切片中Fe元素原位定量分析方法，并采用自行制备的均匀的山羊脑和牛肝组织切片标准样品验证了方法的有效性和可靠性。在下一步的研究中，本方法将应用到小鼠脑组织切片中铁元素的二维原位微区扫描中，给出小鼠脑组织中铁元素的原位、微区定量测量及成像分布结果，这将对于脑中铁元素的分布变化与老年痴呆病的联系研究具有重要的临床意义。 　　2实验部分 　　2.1仪器与试剂 　　UP213 Nd：YAG激光剥蚀系统（美国New Wave公司），高分辨电感耦合等离子体质谱仪（ELEMENT 2，美国Thermo公司），全自动冷冻切片机（德国SLEE公司），免疫组化笔（Liquid blocker pen，美国Sigma公司）。 　　本实验中所用的山羊脑组织样