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在线测定秦皮甲素和秦皮乙素水解反应速率常数ど集擦鞫注射芯片毛细管胶束电动色谱方法 　　摘 要 建立了在线测定秦皮甲素和秦皮乙素水解反应速率常数的扫集流动注射胶束电动色谱新方法。该方法进样频率为12次/h，可在5 min内完全分离反应体系中的所有组分，30 min即可完成一个温度下的反应速率常数测定。由于该在线测定方法不需要终止水解反应，通过一次连续进样分析得到水解反应过程电泳谱图，从而可以获得水解反应过程中的一些信息。在最佳条件时，用0.1 mol/L KOH为催化剂，测得25， 30， 35， 40和45℃时秦皮甲素的水解反应速率常数分别为3.65×10 　　1 引 言 　　秦皮作为一种常用的中药，已经有2000多年的历史，对治疗腹泻、痢疾、咳嗽和一些妇科疾病有很好的疗效，并且有一定的防癌作用[1，2]。秦皮甲素（Aesculin）和秦皮乙素（Aesculetin）是秦皮的两种主要有效成分，其结构如图1所示。药理实验表明，秦皮甲素可以延长环己烯巴比妥对小鼠的催眠作用，而秦皮乙素则没有此作用；秦皮甲素也不具有秦皮乙素的抗组胺作用以及放松对豚鼠离体气管平滑肌的作用。由于它们在潮湿的环境中性质不稳定，因此建立一种简单、经济、可靠的研究秦皮甲素和秦皮乙素的水解方法对此类药物的质量和稳定性评价具有重要意义。 　　毛细管电泳（Capillary electrophoresis， CE）由于具有所需样品量小、分析时间短和分离效率高的优点而适用于化学反应动力学参数的测定[3～10]。Zhang等[7]利用离线CE方法测定了秦皮甲素碱性水解反应速率常数和活化能。该方法虽然可行，但存在检测反应液中目标化合物需先用磷酸溶液终止反应、每次实验只能得到所需要测定的动力学参数中的一个点等缺点。在测定速率常数时，至少需要对反应过程中5个不同反应时间点的反应液进行分析。若欲测定不同温度、pH值、离子强度、溶剂等条件下的动力学参数，可能需要几十甚至上百次实 　　图1 秦皮甲素和秦皮乙素的化学结构式 　　Fig.1 Chemical structure of aesculin and aesculetin 　　验，这给反应动力学研究带来了极大不便。离线分析表明秦皮甲素水解生成秦皮乙素和葡萄糖。从这一结果看，秦皮甲素的内酯键在碱性条件下似乎是稳定的。然而，Chen等[11]的研究表明，烯醇式和内酯结构很容易在碱性条件下解离。此外，Dodge[12]指出，香豆素的碱性水解和其内酯形成是一个可逆过程，当碱过量时，水解完全。但是，过量的碱一旦被中和，则开始进行逆水解过程，即开始形成香豆素，直到达到平衡点。很明显离线分析只给出了水解反应终止后的秦皮甲素水解反应在平衡状态的信息，而无法获得亚稳状态的一些信息。而这些信息对研究秦皮甲素类药物的物理、化学、生物性质的各个过程可能是非常重要的。迄今为止，测定秦皮乙素水解反应速率常数的工作尚未见报道。由此可知，有必要建立在线研究秦皮甲素和秦皮乙素水解反应的新方法。 　　自从1997年Kubán[ 13]和Fang[14]等分别建立了流动注射毛细管电泳（FIchip CE）技术以来，FIchip CE已经广泛应用于各种分析领域[15～24]， 并在此基础上形成了流动注射芯片毛细管电泳（FIchip CE）。由于具有高样品吞吐量和连续进样等优点，FIchip CE非常适用于化学反应动力学研究。然而，迄今为止，该技术很少用于水解动力学研究中。 　　鉴于此，本研究建立了一种简单快速的在线测定水解反应速率常数的扫集流动注射毛细管胶束电动色谱（SweepingFIchip MEKC）方法， 并将其用于测定秦皮甲素和秦皮乙素的水解反应速率常数。 　　2 实验部分 　　2.1 试剂 　　秦皮甲素和秦皮乙素均购于中国药品生物制品检定所。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）、Na2B4O7、KH2PO4、HCl、KOH和乙腈（ACN）购于天津第二试剂厂。所有试剂均为分析纯。所用水均为蒸馏水。 　　2.2 FIchip CE系统 　　用于在线研究秦皮甲素和秦皮乙素水解反应的装置由K1000 FIA型流动注射分析仪（HITACHI，日本）、H通道微芯片联用接口和HPE100型电泳仪（BioRad 公司，美国）组成，整个装置如图2所示。用一根33 cm的PTFE （0.5 mm I.D.）泵管连接FI的进样阀和分流接口。通过FI的蠕动泵流路将缓冲溶液或水输送到位于试剂环两边的两个20 μL的试剂环中，将样品溶液输送位于中间的样品环中。采用手动进样模式。用恒温水浴控制水解反应温度，用磁力搅拌器混合反应物，置于恒温水浴中的10 mL烧瓶作为反应器与输送载流溶液（即运行缓冲溶液）的柱塞泵相连接。用有效长度为22