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培养基组分及操作参数对抗体多聚体形成影响 　　摘要：近年来，国家食品药品监督管理局基于药物安全性的考虑对于治疗性蛋白的质量提出了更高的要求，而蛋白多聚体能引起人体免疫反应，被认为是关键质量属性（critical quality attributes，CQA）。采用培养基组分添加试验和操作参数控制试验的方法，系统研究了培养基中氧化还原物质和培养过程参数（温度和pH值）对抗体多聚体形成的影响。结果表明，半胱氨酸的添加能显著抑制多聚体的形成，培养基中半胱氨酸添加浓度增至30 mmol/L，多聚体含量下降40%。而铜离子的添加浓度从500 μmol/L降至0 μmol/L，多聚体含量则降低了43%。培养温度从35 ℃降低至32 ℃，重链结合蛋白（BiP）和蛋白二硫键异构酶（PDI）的表达水平均提高了89%，细胞翻译后修饰能力显著加强，分泌至上清液中的抗体多聚体含量相应下降了38%。研究结果明确了生产工艺和产品关键属性之间的关系，为后续设计优化以质量为先导的培养过程，生产质量可控、安全、有效抗体药物奠定了基础。 　　关键词：单克隆抗体；多聚体；氧化还原；操作参数；培养基组分 　　中图分类号：Q943.1 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）02-0029-04 　　收稿日期：2014-11-24 　　基金项目：国家自然科学基金（编号。 　　作者简介：王杰（1987―），女，河北保定人，硕士研究生，研究方向为动物细胞与组织工程。E-mail：ecust12wj@126.com。 　　通信作者：谭文松，教授，研究方向为动物细胞与组织工程。E-mail：wstan@。21世纪以来，食品药品监督管理局对治疗性蛋白药物安全性和功效性要求不断提高，质量监测和控制成为动物细胞大规模培养过程中的研究热点，美国药物与食品监管局和欧洲药物局于2004年提出了在所有的药物开发生产中补充质量设计（quality by design，QbD）理念[1]。 　　多聚体含量是蛋白药物关键质量属性（CQA）之一，越来越受到人们的关注。生产过程中形成的蛋白多聚物会影响最终产品安全性和功效性。Rosenberg指出蛋白多聚体是免疫反应的强力诱导者，仅10%的多聚体含量就会引发人的免疫反应，甚至导致人的死亡，因此要严格控制生产过程中多聚体的形成[2]。 　　蛋白多聚体是通过共价键（例如二硫键），或者非共价键（静电作用和疏水作用）的连接形成的[3]。抗体二硫键连接发生在内质网中，内质网的氧化还原电势将直接影响到抗体二硫键的连接。培养过程中的控制参数（pH值和温度）已被广泛证明会影响细胞生理状态，影响抗体表达，折叠和翻译后修饰，Yoon 等报道，降低培养温度至33.5 ℃，使EPO的比生成速率提高了4倍，使EPO的产量提高了2.4倍[4]。Muthing等报道pH值影响了杂交瘤细胞表达的单克隆抗体的半乳糖和唾液酸的含量[5]。抗体分泌到胞外后已正确连接的二硫键又会被氧化还原物质还原和重构，形成蛋白多聚体[6]。而为防止因活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的细胞凋亡，培养基中一般均会添加谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸等还原物质，这可能会加速蛋白多聚体的形成。基于QbD理念基础，亟须研究培养过程参数及培养基组成对蛋白多聚体形成的影响，深入理解多聚体和生产工艺之间的联系，建立多聚体与过程参数的关系，从而减少最终产品多聚体含量，保证实现质量设计。 　　我们采用培养基组分添加试验和操作参数控制试验的方法，系统研究了培养基中氧化还原物质和培养过程参数（温度和pH值）对抗体多聚体形成的影响。研究结果为后续在质量设计（QbD）指导下进行工艺开发提供了数据支持，为建立质量可控的培养工艺奠定了基础。 　　1材料与方法 　　1.1细胞株与培养基 　　试验所用细胞株为表达单克隆抗体-A（Mab-A）的CHO细胞。 　　基础培养基和流加培养基均由华东理工大学生物反应器国家重点实验室自主研发，其中流加培养基由多种氨基酸、维生素以及葡萄糖组成。 　　1.2培养基组分添加试验 　　培养基组分添加试验分为2组：还原组分添加试验和氧化组分添加试验。还原组分添加试验中，选取了5个常用还原剂谷胱甘肽（GSH）、二巯基苏糖醇（DDT）、β-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）、维生素C以及半胱氨酸（cysteine），具体添加浓度见表1，其中试验组6为未添加上述还原剂的阴性对照。试验组1～5设定的添加浓度均为基础培养基添加浓度的3～10倍。氧化组分添加试验选取了CuSO4和胱氨酸这2种氧化剂（表1）。添加Cu2+试验中添加了不同浓度的铜离子，未添加铜离子作为阴性对照组。添加胱氨酸试验中的对照未添加胱氨酸。