姜黄素对APPPS1双转基因小鼠海马CA1区AKT及pAKT表达影响.docVIP

姜黄素对APPPS1双转基因小鼠海马CA1区AKT及pAKT表达影响 　　[摘要] 目的：观察姜黄素对AD模型APP/PS1双转基因小鼠丝/苏氨酸激酶（serine-threonine kinase， AKT，又称PKB）和磷酸化的丝/苏氨酸激酶（phosphorylated serine-threonine kinase， 即p-AKT）表达的影响。方法：将3月龄的APP/PS1双转基因小鼠随机分为5组，分别为模型组、罗格列酮组（10 mg·kg-1·d-1）、姜黄素高、中、低剂量组（400，200，100 mg·kg-1·d-1），选取同月龄同背景的非转基因小鼠为对照组。连续灌胃3个月后，应用免疫组织化学和Western blot方法检测小鼠海马CA1区中AKT和p-AKT的蛋白表达。结果： 免疫组化染色，模型组小鼠大脑海马CA1区AKT和p-AKT阳性细胞均较对照组明显减少（P0.05，P0.01），与模型组相比，罗格列酮组与姜黄素高、中剂量组AKT和p-AKT阳性细胞均有明显恢复（P0.05，P0.01），其中姜黄素中剂量组p-AKT阳性细胞数增加最为显著（P0.01）。Western blot检测结果与免疫组化结果基本一致。结论：姜黄素可以使AD模型APP/PS1双转基因小鼠海马CA1区中减少的AKT和p-AKT细胞有所恢复，提示姜黄素可能通过调节AKT及其磷酸化过程，从而进一步调节PI3K/AKT途径的胰岛素信号转导通路发挥抗AD作用。 　　[关键词]姜黄素；APP/PS1双转基因小鼠；丝/苏氨酸激酶；磷酸化的丝/苏氨酸激酶 　　迄今为止，阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）的发病机制还不十分确切，研究表明，脑内胰岛素缺乏及胰岛素抵抗所致的脑胰岛素信号转导障碍是散发性AD（sporadic AD，SAD）神经变性病级联反应的核心环节[1-2]。磷酯酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3-kinase， PI3K）/AKT途径是目前公认的主要胰岛素信号通路之一。AKT是PI3K下游的直接效应器，AKT激酶的活化可以使许多底物磷酸化，从而调控多种细胞生物功能[3-4]。PI3K可通过激活AKT/蛋白激酶B （protein kinase B，PKB）和抑制糖原合酶激酶3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3β）来刺激葡萄糖运输和抑制细胞凋亡，PI3K/AKT途径的胰岛素信号通路损伤可以降低AKT活性以及提高GSK-3β的活性[2]，导致tau蛋白的超磷酸化，并在细胞内聚集为双螺旋丝，最终可造成神经元的死亡和丢失。此外，通过PI3K/AKT通路的正向刺激作用可保持线粒体膜的完整性，对导致线粒体DNA损伤、线粒体功能障碍和促凋亡的自由基生成起到抑制作用[1]。因此，AKT，尤其是其磷酸化活化形式p-AKT蛋白的表达在AD发生发展的过程中起着至关重要的作用。 　　研究表明，中药单体姜黄素可通过抗炎、抗氧化、抑制β淀粉样蛋白（β-amyloid，Aβ）聚积、调节胰岛素转导通路等多种机制发挥抗神经退行性变的作用[5-6]，本研究从胰岛素转导通路的PI3K/AKT途径，进一步研究中药单体姜黄素对AKT和p-AKT表达的影响，为寻找具有神经保护作用的姜黄素的潜在标靶提供依据。 　　1材料 　　1.1试剂 姜黄素（美国Sigma-Aldrich公司，批号c1386）；马来酸罗格列酮片[葛兰素史克（天津）有限公司，批；羧甲基纤维素钠（CMC，北京精求化工有限责任公司，批号3405005），用前配成0.5%质量浓度，储存于4 ℃冰箱；一抗兔抗小鼠AKT抗体（Abcam公司，免疫组化效价1∶100，Western blot效价1∶500）；p-AKT抗体（Cell signaling公司，免疫组化效价1∶50，Western blot效价1∶500）；SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；Western blot常规试剂SDS凝胶配制试剂盒，RIPA组织/细胞裂解液，Tris base，十二烷基硫酸钠（SDS），过硫酸胺（ammonium persulfate，APS），脱脂奶粉，甘氨酸均为北京环亚泰克生物医学技术有限公司生产；ECL超敏底物化学发光检测试剂盒购自尚柏生物医学技术（北京）有限公司；PVDF膜（Millipore公司）。 　　1.2仪器 Mini-PROTEAN 3电泳仪购自BIO-RAD公司。 　　1.3动物 60只3月龄APP/PS1双转基因小鼠与12只同背景同月龄C57/BL6J正常小鼠，均购自中国医学科学院动物研究所，许可证号SCXK（京） 2009-0004，体重22～