TLR2及TLR4活化对人骨髓间充质干细胞造血支持功能的影响-内科学(血液病)专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 2 英文缩略词表 英文简称 英文全称 中文释义 CFC Colony forming cell 克隆形成细胞 CFU Colony forming unit 克隆形成单位 CSF Colony-stimulating factor 集落刺激因子 GVHD Graft versus host disease 移植物抗宿主病 HMGB1 High mobility group box 1 高迁移率族蛋白 B1 HSCs Hematopoietic stem cells 造血干细胞 HSP Heat shock protein 热休克蛋白 HSPCs Hematopoietic stem/progenitor cells 造血干祖细胞 IL Interleukin 白细胞介素 LPS Lipopolysaccharide 脂多糖 MNCs Mononuclear cells 单个核细胞 MSCs Mesenchymal stromal cells 间充质干细胞 PAMPs Pathogen-associated molecular patterns 病原相关分子模式 TNCs Total nucleated cells 总有核细胞 TLRs Toll-like receptors Toll 样受体 SCF Stem cell factor 干细胞因子 UCB Umbilical cord blood. 脐带血 TLR2 及 TLR4 活化对人骨髓间充质干细胞造血支持 功能的影响 中文摘要 背景和目的：Toll 样受体（Toll-like receptors, TLRs）是近年来发现的一类 天然免疫受体，在激活天然免疫和获得性免疫中发挥重要的作用。间充质干细胞 （mesenchymal stromal cells, MSC）是一种具有高度自我更新能力和多向分化潜 能的成体干细胞。最近研究表明 Toll 样受体（toll-like receptors）可表达于 MSC 表面，并且可以调节其免疫调节、迁移、损伤组织修复等多种生物学功能。作为 造血微环境的主要组成细胞，MSC 参与造血生成，但迄今为止，TLR 受体对 MSC 造血支持功能的调控尚不清楚。本文将研究 TLR2 及 TLR4 对 MSC 造血支 持功能的影响，并对其作用机制进行初步研究。 方法 ： 应用 Ficoll 法 体 外 分 离 培 养 健 康 供 者 的 骨 髓 来 源 的 间 充 质 干 细 胞 （BM-MSC），流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面 CD14、CD34、CD31、 CD45、HLA-DR、CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13 及 CD73 的表 达，并利用体外诱导分化实验检测 BM-MSC 的成脂及成骨分化能力，鉴定 MSC。 RT-PCR 分析 BM-MSC 内 TLR1-10 的表达，同时应用流式细胞术分析其表面 TLR2 及 TLR4 的表达水平。利用 TLR2 激动剂（PAM3CSK4）或（和）TLR4 激 动剂（LPS）刺激 BM-MSC，MACS 磁珠分选系统分离出新鲜脐血的 CD34+ 造 血干祖细胞，将分选的 CD34+与 BM-MSC 共培养，收集不同培养时间点的细胞， 进行克隆形成实验和有核细胞计数，并利用流式细胞术分析扩增后细胞的多种分 化指标（CD3、CD19、Gly-a、CD41a、CD13、CD11b、CD11c、CD14）的表达 情况；了解 TLR2 或（和）TLR4 的活化对 BM-MSC 支持 CD34+造血干祖细胞增 殖和分化的影响。同时应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测 PAM3CSK4 或（和） LPS 活化 BM-MSC 不同时间后，多种相关造血生长因子（IL-1、IL-3、IL-8、IL-11、 G-CSF、GM-CSF、SCF、M-CSF 及 EPO）分泌水平的变化。 结果：流式结果显示 BM-MSC 表达 CD90、CD105、CD166、CD29、CD44、CD13 及 CD73，不表达 CD14、CD34、CD31、CD45 及 HLA-DR，BM-MSC 能够体外 诱导分化成成骨细胞及脂肪细胞；RT-PCR 分析表明在 mRNA 水平，BM-MSC 表达 TLR1-6，不表达 TLR7-10，流式细胞术进一步证实其表面有 TLR2 及 TLR4 的表达；在给予 PAM3CSK4 或 LPS 短暂刺激 BM-MSC24 小时后，能够显著增强 CD34+ 细胞的体外扩增能力；扩增后细胞进行克隆形成实验表明，对照组的总 集落（CFU-total），粒系集落形成单位（CFU-G）、爆发式红系形成单位（BF