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沙田柚GDSL酯酶脂肪酶基因鉴定及序列分析 　　摘要：利用高通量测序技术对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序。通过差异分析得到GDSL酯酶/脂肪酶的基因序列，该基因全长1 306 bp（GenBank登录号：KU159279），开放阅读框（简称ORF）全长1 104 bp，共编码367个氨基酸，编码的蛋白质分子量为40.09 ku，理论等电点为6.44，含有1个与SGNH蛋白相同的保守结构域（conserved active sites，简称CAS）；GDSL基因在沙田柚自交1 d花柱中的表达量（简称RPKM）为4.68，2 d为2.41，3 d则迅速下降到0.27；在异交1 d花柱中该基因的表达量为4.48，2 d迅速升高至7.43，3 d仍维持较高水平为4.37；系统进化树显示，沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因与甜橙（Citrus sinensis）亲缘关系很近，属于同一进化分支。 　　关键词：沙田柚；GDSL酯酶/脂肪酶基因；序列分析；鉴定 　　中图分类号： S666.301文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）11-0045-04[HS）][HT9.SS] 　　植物自交不亲和是指具有完全花且能够产生雌雄配子，雌蕊的柱头或花柱能特异性识别与自体基因型相同的花粉，导致花粉不萌发或花粉管停止生长的一种现象[1]。在高等植物中，据估计有超过一半的显花植物表现出自交不亲和性，这种现象在被子植物中尤其明显[2]。自交不亲和对植物保持遗传多样性以及杂种优势有着极其重要的作用。 　　目前，植物自交不亲和性的研究取得了较大进展。在茄科、车前草科、罂粟科，自交不亲和物种利用胞外核糖核酸酶（简称S-RNase）阻止花粉管的生长[3]。在蔷薇科、玄参科中，自交不亲和现象受S位点相关的F-box基因SLF的调控，这些基因能在花粉中特异性表达[4]。此外，一些基因也参与了植物自交不亲和反应，如参与防御的蛋白质可能在花粉萌发以及花粉管延伸到生长停止、破裂等一系列过程中发挥作用[5]。Distefano等发现与花粉特异性识别以及花粉管定向生长有关的蛋白表现出多样化特性[6]。钙离子在调节花粉管的生长方面也有重要作用[7-8]。 　　沙田柚属于配子体高度自交不亲和的果树。目前，沙田柚自交不亲和的研究在蛋白质化学、细胞学、形态学方面取得了一定的进展。薛妙男等发现，沙田柚自交花粉管停止生长的位置在花柱的1/2处[9]。杨继华等对沙田柚自交花柱特异蛋白的分子量、等电点、N-末端氨基酸序列进行了测定[10-11]。秦新民等对沙田柚花粉管特异蛋白进行了分离和鉴定[12]。同时，花柱通道细胞中特异蛋白以及花粉管中特异蛋白的产生部位及分布也得到确定[13-15]。 　　GDSL酯酶/脂肪酶因具有保守结构域（GDS）（L）保守区而得名，其中，G、D、S分别代表甘氨酸、天冬氨酸、丝氨酸。目前，尚未见GDSL酯酶/脂肪酶基因与植物授粉和自交不亲和性相关的研究报道。笔者对沙田柚自交和异交花柱进行转录组测序，通过对所测的Unigenes功能进行注释，获得了沙田柚GDSL酯酶/脂肪酶基因，对该基因编码蛋白质的理化特征、在沙田柚自交与异交花柱中的表达进行了分析，旨在为深入研究GDSL酯酶/脂肪酶基因的生理功能以及沙田柚自交不亲和的分子机制提供依据。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　沙田柚试验材料取自广西壮族自治区桂林市灵川县潮田乡大山口村果园10年生结果树。取盛花期人工自交授粉（沙田柚×沙田柚）和异交授粉（酸柚×沙田柚）后1～3 d的花柱及当天开花的未授粉的花柱为试材，立即于液氮中速冻，并保存在-80 ℃超低温冰箱中。 　　1.2试验方法 　　1.2.1RNA的提取、建库及测序 　　RNA的提取按改良的 Trizol 法[16]进行，RNA检测合格后交由深圳华大基因科技服务有限公司建库测序，每个样品产生8 Gb数据（资料另文发表）。首先用带有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，然后将 mRNA 随机打断成片段，以这些RNA片段为模板，用随机引物合成第1条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、核糖核酸酶H（简称RNase H）、DNA聚合酶Ⅰ（简称DNA polymeraseⅠ）合成第2条cDNA链。cDNA链经试剂盒纯化并加EB缓冲液洗脱之后做末端修复、加poly（A）并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳检测文库插入片段大小，最后进行PCR扩增，制备好的文库用Illumina HiSeqTM 2000进行测序。 　　1.2.2[JP+1]序列分析和系统树构建 　　使用DNAman、SWISS-MODEL、NetPhos 2.0、TMPRED、Finder等软件对测序所得序列进行序列及蛋白质理化性质分析。基于氨基