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洋葱查尔酮合成酶基因分子克隆和表达分析 　　摘 要:查尔酮合成酶是类黄酮类物质合成的关键酶。本研究克隆了洋葱的查尔酮合成酶基因AcCHS1和AcCHS2。AcCHS1的ORF序列 1 182 bp,编码393个氨基酸残基;AcCHS2的ORF序列1 176 bp,编码391个氨基酸残基。在同等条件下,AcCHS2基因的表达明显高于AcCHS1。 　　关键词:洋葱;类黄酮;查尔酮合成酶基因;基因克隆;基因表达 　　中图分类号:Q785 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2010)05-0001-04 　　 　　洋葱(Allium cepa L.)是百合科葱属二年生草本植物,是类黄酮含量较高的蔬菜种类之一,别名洋蒜、圆葱、葱头等。它以肥大的肉质鳞茎为产品,根据其皮色可分为红皮、黄皮和白皮等品种[1～3]。它是世界上重要的蔬菜作物,欧美国家誉之为“菜中皇后”。 洋葱具有适应性强、耐贮运、供应期长、产量高、效益好等特点,不仅可以鲜食,而且还是很好的加工原料,已成为我国主要的出口创汇蔬菜之一[4]。 　　类黄酮(flavonoids)是自然界中存在的酚类物质,属植物次级代谢产物。它具有广泛的生物活性和重要的药用价值,对人体健康有重要影响,在防治心脑血管疾病、抗肿瘤、抗自由基、抗氧化、抗过敏、消炎、抗病毒等方面有重要作用[5]。因此生物类黄酮已引起国内外学者的广泛关注, 成为研究开发的热点。 　　类黄酮系色原烷或色原酮的衍生物, 其基本骨架具有C6-C3-C6 的特点, 即由两个芳香环A和B, 通过中央三碳链相互连结而成的一系列化合物。其生物合成前体为丙二酰CoA 和对香豆酰CoA,由查尔酮合成酶(Chalcone Synthase,CHS)催化二者形成查尔酮,再在查尔酮异构酶(Chalcone Isomerase,CHI)催化下,使查尔酮的中央三碳链和氧形成闭合的C环。可见查尔酮合成酶是类黄酮基本骨架形成的第一个关键酶[6,7]。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 植物材料 　　以洋葱的新鲜叶片和花为材料,采自山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地,取样后迅速放入液氮中冷冻,于-80℃保存备用。 　　1.2 RNA提取 　　洋葱的总RNA用RNAsimple总RNA提取试剂盒(Tiangen,北京)提取,cDNA 第一链的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen,北京)完成。 　　1.3 PCR反应 　　本研究所用的一组引物P1: 5′-CATGTCCAAGATCAACATCGATGAG-3′和P2: 5′-CAATCCCGAACGCACCCATTAACA-3′以及另一组引物P3: 5′-CACTACACTTAACTGAACCATGTC-3′和P4: 5′-CCTAACCATCAATGGCCACACT-3′,由博尚生物技术有限公司合成。 　　PCR反应总体积为25 μl,其中模板cDNA 1 μl,2.5 mmol/L dNTPs 2 μl,引物各0.5 μl,10×Ex-Taq buffer 2.5 μl,Ex-Taq DNA polymerase(Takara,大连)0.13 μl,用灭菌蒸馏水补充至25 μl。扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性30 s,58℃退火 1 min,72℃延伸1 min 30 s,35个循环;最后72℃保温8 min。 　　1.4 目的片段的克隆 　　扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,然后在凝胶成像系统上检测并照相记录,分子量Marker DL2000从大到小依次为:2000、1000、750、500、250和100 bp。 　　PCR 扩增产物用凝胶回收试剂盒(Tiangen,北京)进行回收,与克隆载体pMD18-T(Takara,大连)连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆送到博尚生物技术有限公司进行测序。 　　1.5 序列分析 　　序列比对在GenBank(/blast/Blast.cgi)进行。生物信息学分析主要采用DNAMAN 软件及 、/等链接的网上软件进行。 　　1.6 基因表达半定量分析 　　用AcTublin作为内标,所用上游引物为5′-CCATCTCCTCAGGTCTCAACTTC-3′,下游引物为5′-CGCTTCGTCTTTATTGTCGCCA-3′。通过PCR产物条带的亮度调整模板cDNA的浓度,使其达到一致。然后再用基因特异引物进行扩增,PCR循环25～30次,对电泳结果进行记录和分析。 　　 　　2 结果与分析 　　 　　2.1 洋葱AcCHS1和AcCHS2基因的克隆 　　洋葱 RT-PCR 产物