对茶树炭疽病病菌具拮抗作用根际促生细菌分离筛选及鉴定.docVIP

对茶树炭疽病病菌具拮抗作用根际促生细菌分离筛选及鉴定 　　摘要：为了筛选出对茶树炭疽病病菌具有拮抗作用的根际促生细菌，从河南省信阳市茶园采集85份土样，分离得到23株具有拮抗作用的细菌，利用平板对峙法筛选出对胶孢炭疽菌具有较强拮抗作用的7株细菌菌株，且其代谢产物对茶树炭疽病病菌的平均抑制率达到53.20%。依据生理生化特征经初步鉴定，7株拮抗菌株均隶属于芽孢杆菌属。试验结果为进一步构建多功能植物根际促生菌广适菌群提供菌株资源。 　　关键词：茶树；炭疽病病菌；拮抗作用；根际促生细菌；筛选 　　中图分类号： S435.711文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）11-0076-03[HS）][HT9.SS] 　　茶树炭疽病是一种由真菌侵染引起的病害，是常见的茶树叶部病害之一，在我国各产茶区均有发生，山区茶园尤为普遍[1]，该病发病严重时可导致茶树大量落叶，并造成茶树树势衰落和茶叶产量与品质降低，还影响翌年春季茶叶的产量。 　　目前，茶园主要利用化学药剂防治茶树炭疽病，但长期使用化学药剂会导致病原菌抗药性增强，并可造成农药残留、环境污染等一系列问题。在化肥农药零增长的大背景下，如何开发生物制剂来防治茶树炭疽病尤为重要。植物根际促生菌（plant growth-promoting rhizobacteria，简称PGPR）指生存于植物根际、根表，并能直接或间接地促进或调节植物生长的微生物[2]，它能够通过多种机制促进植物的生长，目前人们普遍认同的生物学功能主要有拮抗病原菌、诱导系统抗性、改善根际微生态环境等[3]。国外研究人员已从水稻、小麦、玉米、甘蔗和棉花等作物根际分离筛选出许多高效、优良的促生菌株，并且部分菌株已实现商业化[4-6]。陈波等分离筛选出对樱桃生长有明显促进作用的假单胞菌属（Pseudomonas sp.）[7]；史国英等分离得到1株对甘蔗具有促生作用的细菌，经鉴定为克雷伯氏菌属（Klebsiella sp.）细菌[8]；周晨昊等研究发现，将筛选到的1株植物根际促生细菌JD37与蚯蚓粪混合对小白菜与蕹菜具有显著的促生作用，其鲜质量和产量均有明显提高，还具有降低2种蔬菜中亚硝酸盐含量的作用[9]。 　　本研究从茶树根际土壤中分离PGPR，初步研究其对茶树炭疽病病菌的拮抗作用，通过形态学和生理生化特性对其鉴定，为构建高效广适促生菌群提供菌株材料。 　　1材料与方法 　　1.1供试样品 　　从河南省信阳市?负痈壅颉⒍?家河、震雷山、信阳农林学院等地的茶园中，共采集85份根际土壤样品，放入自封袋，分别标记为SHG、DJH、ZLS、XYNL，并加以编号，置于4 ℃冰箱中保存备用。 　　1.2供试培养基[10] 　　PDA培?B基：200 g去皮马铃薯、20 g葡萄糖、18 g琼脂；NA培养基：5 g牛肉浸膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl、18 g琼脂、pH值为7.2；NB培养液：3 g牛肉浸出膏、5 g蛋白胨、5 g NaCl、1 000 mL水、pH值为7.0～7.2。 　　1.3供试病原真菌 　　盘长孢菌（Gloeosporium theae-sinesis Miyake）由信阳农林学院农药学实验室分离和保存。 　　1.4细菌的分离和纯化 　　称取10 g土样，加入装有90 mL无菌水的250 mL三角瓶中，于120 r/min摇床上振荡30 min，即为10-1稀释液，取 1 mL 10-1 稀释液加入盛有9 mL无菌水的试管中，即为10-2稀释液，依此类推，用无菌水稀释成10-3～10-7稀释液，分别取5 μL涂布于3种固态培养基平板上，每个浓度重复3次，置于26～27 ℃恒温箱中培养3～5 d后，挑取单菌落作为参试菌株。 　　1.5对茶树炭疽病病原菌拮抗作用的测定 　　1.5.1[JP2]细菌菌株对茶树炭疽病病原菌拮抗性测定 　　采用对峙生长法测定茶树根际细菌对胶孢炭疽菌的拮抗性。即在直径为9 cm的PDA平板正中央接入直径为5 mm的胶孢炭疽菌菌块，同时在距平板中心2.5 cm处的4个点上分别接入1环目标细菌菌落，对照不接筛选菌株，只接入培养基，于 27 ℃ 恒温箱内培养72 h，测量从茶树根际土壤中筛选的细菌的菌落边缘和茶树炭疽病病原菌菌落边缘之间的抑菌带宽度，筛选出对茶树炭疽病病原菌具有拮抗作用的菌株。同时观察筛选菌的菌落大小和生长速度，选出拮抗作用明显的细菌。[JP] 　　1.5.2拮抗细菌代谢产物对供试病原菌的抑制作用 　　将初筛的拮抗细菌于NB培养液中28 ℃振荡培养3 d，将发酵液以8 000 r/min离心15 min，取上清液，最后用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，每个处理重复3次。将2 mL无菌滤液和20 mL NA培养基混合均