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我国核桃组种质资源SSR标记分析 　　摘 要：为从基因水平对我国核桃组资源的遗传多样性进行分析，用9对SSR引物对核桃组中29份核桃(Juglansregia L．)样品、2份铁核桃(J. sigillata D．)样品、4份J.ataD．xJ.regia L.样品进行扩增，共检测出等位基因47个，每个位点扩增3―9个等位基因，平均5.2个。9个SSR位点的PIC值在0.318 8～0.790 2，平均为0.635 7。35个样品在9个SSR位点上有杂合位点1～6个，样品的杂合度在0.11～0.67，平均0.35。采用UPGMA方法进行聚类分析，35个样品可以分为4组。其中陕西晚实核桃与华北核桃聚为一类，陕西早实核桃聚为一类再与新疆核桃聚为一组，表明秦巴山地核桃可能属于华北和新疆2个地理生态型。铁核桃与西藏核桃聚为一组，说明铁核桃与西藏核桃的亲缘关系较近，认为铁核桃和西藏核桃作为核桃种下的一个生态类型可能更为合适。 　　关键词：核桃；铁核桃；SSR；地理生态型；杂合度 　　中图分类号：S664．1 文献标识码：A 　　文章编号：1009―9980(2007)05―620-06 　　 　　我国是核桃属(Juglans)植物的起源和分布中心之一。核桃属有20多个种，分4个组，即核桃组(Sect．Juglans)、核桃楸组(Sect．Cardiocaryon)、黑核桃组(Sect．Rhysocmpon)和灰核桃组(Sect．Trachy-caryon)，其中核桃组包括核桃(J/.regia)和铁核桃(J.sigillata)2个种。我国核桃和铁核桃的种质资源非常丰富，为核桃的遗传改良和新品种培育提供了丰富的材料。以往对核桃种质资源的研究多依靠形态学、细胞学、酶学等手段。近年来，DNA分子标记由于具有多态性高、不受组织类别、发育时期和环境条件影响，越来越多地应用于核桃种质资源研究。吴燕民等用RAPD对核桃属种间亲缘关系及核桃种内不同地理生态型进行了研究，结果与经典分类学的结果基本一致。Fjellstrom等用用RFLPs标记分析了48份核桃品种的遗传关系，聚类分析表明。加州的核桃品种与法国和伊朗的品种的遗传关系较近，而与中国、日本的品种遗传关系较远。Nicese等用RAPD标记分析了19个核桃品种的亲缘关系，表明RAPD标记能将准确反映彼此的系谱关系。Potter等用ISSR标记分析了48个核桃品种的遗传关系后指出，由于ISSR呈显性遗传，在分析品种间的遗传关系上可能SSR标记更有优势。Woeste等通过构建微卫星文库，从黑核桃中开发出30对SSR引物。Dang等应用SSR标记对主要来自欧美的48份资源进行了遗传多样性分析。目前，有关我国核桃组种质资源的分子标记研究报道很少。我们采用9个SSR标记对我国核桃组种质资源进行分析，以探讨我国栽培核桃的遗传关系，在此基础上进行分子系统分类的初步研究。为SSR标记进一步用于核桃的遗传演化、品种鉴定及分子标记辅助育种奠定基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1材料 　　试材包括：29份核桃(J.regia L)样品、2份铁核桃(J.sigillata D．)样品和4个J.sigillata D．xJ.regia L．的后代优良无性系。 　　 　　1．2方法 　　1．2．1 DNA提取与检测DNA的提取参照Nicese等的方法。用紫外分光光度计(Pharmcia，UltrospecⅢ)测定DNA的浓度和纯度。 　　1．2．2 引物来源及合成 SSR引物从黑核桃(J.nigra)中提取的引物中选出，由上海生工生物工程技术服务有限公司(sangon)合成，SSR引物序列特征见表1。 　　 　　1．2．3 PCR扩增反应体系 20μLPCR反应体系中包括：10xBuffer (15 mmol/L Mg2+2.0 μL、dNTPs 0.2mmol/L、引物均为0.2 μmol/L、Blend Taq DNA酶1 u、模板DNA40 ng。 　　扩增在T1 Theromcycler PCR仪(Biometra)上进行。Touch Down扩增程序为：95℃预变性3 min，进入第1阶段循环，94℃变性30 s，55℃复性45 s，72℃延伸45 s，共16个循环，每个循环复性温度下降0.5℃；然后进入第2阶段循环，94℃变性30 s，47℃复性45 s，72℃延伸45 s，循环30次，共46个循环。最后在72℃延伸8 min，4 cc保存。 　　1．2．4 电泳及银染 5 μL扩增产物+3μL变性上样缓冲液，95℃变性5 min后迅速冷却，取4 μL点样，用6％变性聚丙烯酰胺凝胶，DYY―12型电泳仪800 V电泳3 h。电泳完成后，用10％乙醇固定5min