我国葡萄主栽区卷叶病相关病毒种类检测分析.docVIP

我国葡萄主栽区卷叶病相关病毒种类检测分析 　　摘要：田间调查200个葡萄品种，结果82个品种表现葡萄卷叶病症状，其中欧亚种群表现葡萄卷叶病症状的品种最多，发病率最高，发病症状最重；欧美杂种发病率和严重度均比欧亚种群低；未发现美洲种群的品种表现葡萄卷叶病症状。从58株表现卷叶病的葡萄上采集休眠枝条进行卷叶病毒ELISA和RT―PcR检测，葡萄卷叶病毒-1，2，3，4，5和7(GLRaV-1，2，3，4，5和7)等6种葡萄卷叶病毒的检出率分别为20.7％，17.2％，621％，3.4％，5.2％和15.5％。回收PCR产物进行克隆和序列分析，并将测序结果提交至GeneBank。以葡萄卷叶病毒且HSP70基因序列构建系统进化树分析其进化关系，GLRaV-1、3和7，GLRav-2、4和5分别聚为2大类，其中GLRaV-1和3，GLRaV-4和5在各自的聚类中关系更近。 　　关键词：葡萄卷叶病毒；田间调查；ELISA；RT―PCR；进化树 　　中图分类号：S663.1　文献标识码：A　文章编号：1009―9980(2011)03―463―06 　　 　　葡萄卷叶病(Grapevine leafroll di’sease，GLD)是分布最广泛。危害最为严重的葡萄病毒病之一。葡萄一旦感病，便终生带毒，持久危害，难以用化学药剂防治。染病葡萄树势衰退，嫁接成活率和扦插生根率降低，果实成熟期推迟，果穗着色不良，含糖量降低，发病严重的葡萄园，产量损失超过45％。迄今为止，全世界已报道了11种血清学不相关的葡萄卷叶病毒，分别命名为GLRaV-1，2，3，4，5，6，7，8，9，Pr和De，分类上属于长线病毒科(Closteroviridoe)，上述病毒单独或复合侵染都能引起葡萄卷叶病的发生。目前国内对GLRaVs的研究主要集中在对GLRaV-3的检测技术，基因克隆和表达的研究，而对于我国葡萄卷叶病原的分析研究比较少。 　　在生产中，葡萄叶片的症状表现是田间识别葡萄卷叶病的重要依据，具有较高的诊断价值，我们通过田间调查和采样，结合实验室ELISA和RT-PCR检测，对我国葡萄卷叶病毒的种类以及葡萄品种的耐病性做了调查分析。通过对目的基因片段的克隆和序列分析，并与其他GLRaVs分离株的HSP70基因序列进行多重比对和构建系统进化树，旨在对我国葡萄卷叶病病原进化关系有明确的认识，研究结果对我国葡萄卷叶病的防治及对其病原的深入研究均具有重要的意义。 　　 　　1、材料和方法 　　 　　1.1　材料 　　田间调查和采样：田间调查于2009年10月在中国农业科学院果树研究所葡萄品种保存圃内进行，调查200个品种，82(主要来自辽宁，山东，河北，宁夏，新疆等地)个品种表现葡萄卷叶病症状，在其中标记了58株。当年11月份从标记的病株上剪取1-2根1 a生休眠枝条，保存于4℃冰箱中。菌株和质粒：大肠杆菌(Escherichia coli)DH5a感受态购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。克隆载体pMDl8-T购自宝生物工程(大连)有限公司。试剂：M-MLV反转录酶购自普洛麦格公司；dNTPs、TaqDNA聚合酶购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；DNA Marker-D购自上海生工生物工程技术服务有限公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：GLRaV-1，2，3和7抗体购自意大利Agritest公司，GLRaV-5抗体购自香港安德珍生物技术有限公司。所用的引物序列及PCR产物大小见表1。 　　 　　 　　 　　1.2　ELISA检测商品化的抗血清检测 　　按照购买试剂盒操作说明，对58株葡萄样本检测葡萄卷叶病毒-1，2，3，5和7(GLRaV-1，2，3，5，7)。 　　 　　1.3　RT-PCR检测 　　刮取100 mg休眠枝条韧皮部组织，采用改进的二氧化硅吸附法提取总RNA。参考文献[16]进行RT-PCR检测。 　　 　　1.4　引物的特异性和灵敏性 　　为检测引物对的特异性，对相应葡萄卷叶病毒进行了RT-PCR；另外将提取的病毒RNA依次稀释10-110-6倍，利用RT-PCR检测其灵敏性。 　　 　　1.5　目的基因克隆和序列分析 　　将扩增得到的RT-PCR产物用PCR FragmentRecovery Kit(TaKaRa)进行回收纯化，与DMDl8-TVector连接后转化E.coli DH5a感受态，挑取白色菌落进行培养，重组质粒由北京诺赛基因组研究中心有限公司测序，将测序结果与NCBI核酸数据库中报道的相应病毒序列进行同源性分析。 　　于NCBI核酸数据库中选取16个GLRaVsHSP70基因序列(AFl95822、AF233935、EU760835、HMl30523、GU4574