沉默egfr基因对mda-mb-231细胞化疗药物敏感性的研究-study on the sensitivity of silent egfr gene to mda - m b - 231 cell chemotherapeutic drugs.docxVIP

华中科技大学硕士学位论文 华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 前 言 乳腺癌是严重威胁女性健康和生命的常见恶性肿瘤，每年约有一百八十万女 性确诊此病[1]。随着研究的不断深入，人们逐渐认识到不同生物学行为的乳腺癌 亚型对判断预后和指导临床治疗显示出越来越重要的作用。根据基因芯片技术， 乳腺癌表达的基因谱进行分类[2]：①Luminal A型；②Luminal B 型；③Her-2 过 表达型；④Normal-like 型； ⑤Basal-like 型。 其中Basal-like型的乳腺癌中，又 有一类特殊的乳腺癌，其ER、PR、Her-2 均为阴性，我们又称为三阴性乳腺癌。 这类乳腺癌占所有乳腺癌类型的10%-20.8%[3]。其对内分泌治疗和Herceptin的靶 向治疗的效果欠佳，虽然对化疗有较好的敏感性，但其复发、局部、远处转移的 风险相比其他四类乳腺癌都要高。目前还没有专门针对三阴性乳腺癌的治疗指 南。为了让患者能够从化疗中最大程度的获益，乳腺癌的个体化治疗逐渐成为医 学发展的趋势[4]。我们需要探寻能够预测乳腺癌患者对化疗药物敏感的分子标记 物，以此来规范我们对化疗药物的使用原则，同时也为科学、合理、有效的开展 个体化治疗提供依据。 表皮生长因子受体（Epidermal growth factor receptor, EGFR）是相对分子量 为170kD的跨膜糖蛋白，具有酪氨酸激酶活性，在包括肺癌、乳腺癌在内的多种 上皮来源的恶性肿瘤中呈高表达，大量的回顾性研究显示EGFR的过表达与肿瘤 的恶性程度、易感性、放化疗敏感度下降密切相关。许多阻滞和下调EGFR的方 法被用来抑制肿瘤细胞的生长、分化、增殖、迁移以改善预后，因此EGFR目前 被认为是肿瘤基因治疗的重要靶点之一[5]。多项回顾性研究显示EGFR在三阴性 乳腺癌中是过表达的。某些文献报道其过表达率高达65%。而且EGFR是评价三 阴性乳腺癌对化疗敏感性及预后的一个重要指标[6，7，8]。Hiroko等[9]人的回顾性研 究显示EGFR在三阴性乳腺癌中表达率达62%。在三阴性乳腺癌的患者中，EGFR 过表达的患者对化疗的敏感性及生存率明显低于EGFR低表达或不表达的患者。 而Geisler[10]等人的研究发现，标准剂量的蒽环类化疗方案，并不能改善三阴性乳 腺癌患者的预后。但目前还没有前瞻性的研究来表明EGFR的表达情况对三阴性 乳腺癌的预后的影响到底如何，抑制EGFR的表达对三阴性乳腺癌的预后是否会 有积极的影响，是否会与化疗有协同作用？本实验旨在体外应用基因干扰技术研 究EGFR对乳腺癌化疗敏感性的影响。 已证实MDA-MB-231为ER、 PR、 HER-2均为阴性的乳腺癌细胞系，且其 EGFR是过表达的[11]。本实验通过siRNA基因干扰的技术对MDA-MB-231细胞的 EGFR基因进行沉默，从而制备出具有EGFR高表达和EGFR低表达两种不同的细 胞亚系，再对这两种细胞亚系进行多西他赛、阿霉素及5-氟尿嘧啶的药物敏感性 试验，根据实验结果，来分析并回答上述问题。 材料与方法 一、 材料与设备 1 材料来源 人乳腺癌细胞系 MDA-MB-231 细胞系购自中科院上海生科院技术支持中心 细胞库 L15 培养基、胎牛血清、Opti-MEM、RNA 提取试剂 TRIzol 购自 Gibco 公司 胰蛋白酶、Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen 公司， siRNA 基因干扰试剂盒由广州锐博生物技术有限公司设计订购， 实验涉及的引物均由上海英骏生物技术有限公司合成 CCK-8 活细胞计数试剂盒购自日本同仁化学研究所 盐酸表阿霉素购自深圳万乐药业有限公司 多西他赛购自江苏恒瑞制药有限公司 5-氟尿嘧啶购自上海旭东海普药业有限公司 2 主要装置 二氧化碳细胞培养箱 Galaxy B 型 RS Biotech 超净工作台 SW-CJ-1FD 上海精密仪表有限公司 倒置显微镜 Olympus CKX51 日本 低速台式离心机 TD24-WS 湖南湘仪集团 小型高速离心机 Centrifuge5418 德国 Eppendorf 基因扩增仪 T1/Tgradient Biometra 实时荧光定量 PCR 仪 slan 上海宏石医疗科技有限公司 超微量分光光度计 NanoDrop 2000 thermo scientific 酶标仪 iMark Bio-Rad 手压封口 SEALER FS-200 永康市特力包装机械有限公司 电泳仪/小型垂直电泳槽 /转印槽 Powerpac Basic Bio-Rad 气浴恒温振荡器 SHZ-82 常州国华电器有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9123