益肝康单味药对肝星状细胞活化tgfβ1信号通路的影响及其有效成分分析-effect of yigankang on activation of tgf β 1 signaling pathway by hepatic stellate cells and analysis of its effective components.docx

中文摘要 信号的细胞内传导，负向调节 TGF-?l 信号传导通路。 随着肝纤维化发生机制的不断阐明，中西医都在进行防泊肝纤维化的 有益探索 (4些因药的研究取得了…起进展，如干扰素 (Interferon ，IFN) ， 可抗炎症坏死，抗脂质过氧化，抑制 HSCs 撤回，降低 ECM 沉积，对 TGF? 信号转导有一定抑制作用，但其抗肝纤维化确切作用机制尚未明了。在中 医药方面，以活血化赔为主的中医药治疗肝奸维化部取得…定效果，成为 当前研究热点。中药具有多环节、多层次、多靶点的综合药理学作用，可 抑制 HSCs 洒化增植、 ECM 合成，保护肝细胞等，且不良作用较小。活 血化船中珩有效方剂益肝康系重用丹参，辅以当归、赤苟增强活血化 脐作用，并用黄民补气，活血化脐、益气健脾二药相合，一行…补，化脐 益气之功相得益彰。以往系列研究证实其具有改善肝功能、抑制 HSCs 活 化增躏、抑制胶原合成等作用。在掌握单昧药作用机制及有效作用成分基 础上，根据中院药传统理论精简组方，增强疗效是其发展方向。 血清药理学 (seropharmocological method) 方法的提出，对准确再现中 药体内作用提供了可行途径，其应用使获取中药体内有效成分、在细胞， 亚细胞，分子水平研究中药作用机制成为可能。考虑到不同肝脏功能状态 对药物代谢的差异，本研究对正常、病变大鼠同时提取药物血清(传统、 改良血捕药理学方法)进行体外实验。 高效槐阳色i曾分析(high-performance liquid chromatographic analysis， HPLC analysis)是目前进行中药质量控制和有效成分分析的最有效方法之 一，可将中药内各种复杂组分遥…分离，进行定量分析。通过 HPLC 分离 出中药单味到及复方中的有效作用成分，可进行药理、药强学研究。本实 验拟采用 HPLCi去分析益肝康内单昧药生药及其相应药物血清内有效 作用成分，并将生药内与正常、病现药物血清内有效成分含最进行对比， 探讨正常、病理不同状态肝脏代谢后对于中药有效成分的影响。 以往益肝康系列研究中，曾对部分单昧药及其对 PDOF、TGF-自 信号通路的影响进行研究。本课题将继续研究复方内单睐药及中药单体的 作用机制，书在讨其对 HSCS1吉化、增殖及 TGF.?l 节游 Smad 信号通路的 影响，书在讨益肝康组方内单味药的可能作用机制及作用成分。 第一部分大鼠药物血靖、中药单体及 IFN-y 对鼠 HSCs 增殖及胶原合成 的影响 中文摘要目的：研究大鼠当归、赤芍、黄芪、丹参+黄芪小复方药物血清，及 中文摘要 目的：研究大鼠当归、赤芍、黄芪、丹参+黄芪小复方药物血清，及 中药单体阿魏酸、芍药苷、黄芪甲苷、原儿茶醛对HSCs增殖及TGF—B1 刺激后胶原合成的影响。 方法：应用HSCs细胞株体外培养技术。分别给正常、CCl4诱导肝纤 维化SD大鼠灌服当归、赤芍、黄芪、丹参+黄芪小复方水煎剂，剂量相 当于成人公斤体重日用量15倍，对照组灌服相应剂量生理盐水。连续灌 服5d，第5d灌胃后2h下腔静脉取血，分离血清，56℃水浴灭活，过滤 除菌。加入无血清RPMI一1640．培养液，配制药物血清。1640培养基。IFN吖、 中药单体阿魏酸、芍药苷、黄芪甲苷、原儿茶醛加入2％RPMI．1640配制 为中药单体．1640培养基，过滤除菌。实验分组： N组：正常大鼠组： NA组：正常大鼠血清干预组；NB组：正常大鼠当归药物血清干预组；Nc 组：正常大鼠赤芍药物血清干预组； ND组：正常大鼠黄芪药物血清干预 组； NE组：正常大鼠丹参+黄芪药物血清干预组。A组：肝纤维化大鼠 组：AA组：肝纤维化大鼠血清干预组；AB组：肝纤维化大鼠当归药物 血清干预组； Ac组：肝纤维化大鼠赤芍药物血清干预组；AD组：肝纤 维化大鼠黄芪药物血清干预组；+AE组：肝纤维化大鼠丹参+黄芪药物血 清干预组。H组：IFN．v干预组；I组：阿魏酸干预组；J组：芍药苷干预 组；K组：黄芪甲苷干预组；L组：原儿茶醛干预组：用上述各干预组培 养液培养HSCs，采用CCK．8(CeU CountingⅪt．8)法检测各干预组对HSCs 增殖影响。采用3H一脯氨酸(3H．Pro)掺入法检测TGF．B1刺激的Hscs I型 胶原分泌能力。 结果：①40％Ccl4造模9w，A组大鼠逐渐出现毛色黯淡，光泽度差， 易激惹，体重增长减缓等现象。大鼠处死时A组大鼠肝脏呈暗红色，表 面不光滑，可见细小颗粒，质韧，边缘变钝。HE染色示肝组织出现明显 炎症坏死，炎细胞浸润，脂肪变性，肝细胞肿胀，肝小叶结构紊乱。Masson 染色示肝小叶结构紊乱，无明显放射状肝细胞索，可见大量、粗大纤维增 生。非造模对照N组大鼠