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扁桃PGIP基因克隆及其序列分析 　　摘 要：以晋扁一号扁桃(Prunus dulcts Mmer.)基因组DNA为模板，用已登录的扁桃PGIP(多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白)基因保守序列设计引物进行PCR扩增，得到了6个PGIP基因片段并克隆到PBS-T载体中。根据测序结果分析，町利用其中的3个片断，分别命名为PdPGIPl(717 bp)，PdPGlie(864 bp)和PdPGIP3(796bp)，与公共数据库中的序列相似性比较，其中PdPGIP2和PdPGIP3各包含2个外显子和1个内含子，内含子符合GT-AG规律。其核苷酸序列分别与Genhank中登录的3个扁桃以及桃(P.Dersica Linn.)、杏(P.arwteniaca Linn，)、美洲李(p.americana Marda)、中国李(P.salicina Lindl.)、马哈利樱桃(P.mahaleb Linnaeus)、苦樱桃　(P.emarginata walp.)、梅(P.mume Sieb.)的mRNA、DNA序列显示出极高的同源性，基本都在90％以上，其中PdPGIPl、PdPGIP2、PdPGIP3与Genbank中登录的3个扁桃PGIP基因的同源性为92％～99％。对氨基酸序列保守性分析发现，含有多数植物PGIP抗病基因表达蛋白特有的亮氢酸重复序列。证明我们所克隆的目的片段为PGIP基因。 　　关键词：扁桃；PGlPDNA；克隆；测序 　　中图分类号：S662.9 文献标识码：A 文章编号：1009―9980(2008)01-54-0 　　 　　扁桃(Prunus dulcis Mill.)，又名巴旦杏、美国大杏仁，是蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物。扁桃流胶病、缩叶病等病害的病原是真菌，主要危害扁桃树干、叶片、花和果实等。多聚半乳糖醛酸酶(PGpolygalacturonase)是多种病原真菌的致病因子，它分解植物多聚半乳糖醛酸，是病原真菌入侵过程中分泌的第一个细胞壁降解酶，它对植物细胞壁的降解不仅使其它细胞壁降解酶对其底物的攻击更容易，而且为真菌的生长和发育提供了大量的糖源。但是此酶的活性被控制后，能催化寡聚糖无毒因子的形成，激活植物的防卫反应。双子叶植物细胞壁中广泛存在有多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(polygalactur-onase-inhibitingprotein，PGIP),它能与PG结合降低和抑制该酶的活性并且诱导寡聚糖的形成，因而在植物的防御反应中起着重要的作用[1-6] 　　PGIP是一种特异性结合和抑制真菌内源PG活性的细胞壁结合蛋白，富含抗病基因所具有的亮氨酸重复序列。PG/P蛋白与PG专一地、可逆的结合，非竞争性地抑制病原菌PG酶的活性。减少了PG对植物细胞壁的降解，从而抑制了这些真菌病害的发生：另外PG/P在与PG的相互作用中使植物细胞壁能形成寡聚半乳糖，从而诱导植物的抗病性反应，使植物获得系统抗病性。另有报道，PGIP还与果实的发育过程、胁迫反应、冷藏、浆果果实的病虫害等有关。因而，PGIP基因已成为目前抗病基因工程和果实耐贮藏基因工程研究的重点。 　　国内外已从树莓[7]、苹果[8]、梨[9]、杏[10]、樱桃[11]、大豆[12]、番茄[13]、马铃薯[14]等植物中克隆了PGIP基因，本研究以晋扁系列扁桃为试材，对其PGIP基因进行克隆和测序，以构建植物表达载体，为培育抗病、耐贮果树新品种奠定基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　 　　1.1　材料 　　材料采自山西省农业科学院果树研究所扁桃试验同，晋扁一号扁桃幼果(黄豆粒大小)。 　　 　　1.2　方法 　　1.2.1基因组DNA的提取和检测 5月上句采回果实，采用改良的CTAB法(参考文献)提取基因组DNA,0.8％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，测定光密度值，确认DNA的质量后，-20℃保存备用。 　　1.2.2　PG/P基因的克隆根据Genebank中已登录的3个扁桃PGIP基因保守序列，设计1对引物，由上海生工公司合成，上游引物为[5]－ACTCTGTCAC－CTGTGACTCC-3.下游引物为5-GACCACA-CAACCTGTFGTAGC-3’。以幼果基因组DNA为模板，进行PCR扩增。引物退火温度的筛选是用梯度PCR仪。从50～60℃，每隔2℃设1个梯度。PCR反应体系及条件为：10×PCR buffer 2.0μL，dNTP(2.5mmo.L)0/5μL，模板DNA(120 ng/L)1.0 μL，引物(20 pmoF/μL)各0.5μL，TaqDNA(5 U/μL)0.2 μL，ddH2O 15.3μL，总体积为20μL。扩增程序为94℃预变性5 min；94℃变性1 min，退火1 min，72℃延伸2 m