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来源途径不同玉米自交系DNA指纹分析 　　[摘要] 利用SSR分子标记技术，对不同来源的玉米自交系P138、Mo17、65232、昌7－2进行DNA指纹检测。检测了75对引物，其中Bnlg1439、Bnlg197、bnlg1194等16对在谱带位置或数量上已出现差异。分析表明，自交系在使用过程中已发生分化或遗传漂移，在自交系提纯复壮中可以利用这16个标记进行辅助选择育种。 　　[关键词] SSR；玉米自交系；DNA指纹 　　自交系是杂交种选育的基础，是育种成功的关键所在。优异自交系选育及其组合选配可以实现突破性新品种的诞生[1]。因而加强对育种材料的研究，挖掘其在种质改良与创新中的利用价值，可促进育种业的发展。选育玉米自交系的材料的遗传背景错综复杂，玉米自交系在其使用过程中还会出现遗传退化和飘移等现象，如选择压力、授粉方式、收获方式、种子繁殖的世代数等，都会导致遗传基础的变异[2]。因而进行品种繁育时，需要对所用自交系进行检测，及时提纯复壮，以保证其遗传特质，保证品系特性，延长品种年限。但是常规的提纯复壮工作复杂，且必须依靠育种家的经验，难于广泛交流应用，分子标记技术为自交系遗传检测和提纯复壮提供了客观、高效方法。 　　一、材料与方法 　　1.自交系及其来源 　　注：硕――内蒙古硕丰种业有限公司，锦――锦州市种子公司，义――锦州市义县种子公司，内――内蒙古民族大学农学院检验室，高――内蒙古高新科技有限公司。 　　2.引物 　　Bnlg1439、Bnlg197、umc2048、phi084、bnlg1613、phi065、phi126、phi082、和bnlg161、bnlg1194、bnlg125、phi072、umc1750、umc2332、bnlg1161和phi96100。（SSR引物序列引自Maize DB，由北京赛百盛公司合成。） 　　3.试验地点 　　内蒙古民族大学农学院 　　4.试验方法 　　（1）DNA提取 　　采用郭景伦玉米单粒种子快速提取方法稍加改进[3]。选取若干粒种子，用刀片将种子切开，取胚，放入1.5mL离心管中，加入100uL氯仿，用锥形玻璃棒研磨。然后加入300uLDNA提取液（100mM pH8.0 Tris-HCL，100mM EDTA，500mM NaCl，1.5%SDS），充分混匀后，12000r/min离心2min，吸取上清液加入预先装有500uL预冷的无水乙醇的1.5mL离心管中，轻轻倒置两次，12000r/min离心2min，到掉上清夜，用70%酒精洗涤沉淀，自然风干后，加入100uL TE或超纯水溶解，待用。用0.8%的琼脂糖电泳检测DNA质量。 　　（2）PCR反应体系 　　（3）PCR扩增程序： 　　 预变性94℃ 4min 　　 变性94℃ 1min 　　 退火60℃ 1min35个循环 　　 延伸72℃ 2min 　　复延伸72℃ 8min 　　 保存4℃ 99.999999…… 　　（4）电泳检测 　　扩增结束后，产物在3.5%的琼脂糖凝胶，1×TAE电泳缓冲液，8V/cm电压梯度恒压下电泳，EB染色，紫外灯光下观测谱带。 　　二、结果与分析 　　1.自交系P138的DNA指纹分析 　　两份自交系P138分别采自于内蒙古民族大学农学院和义县种子公司，用筛选到的引物对他们进行了PCR扩增，共发现4对SSR引物的扩增产物间出现了DNA指纹的差异，不仅有扩增片段大小的不同，而且也存在扩增片段数目上的差异。如在引物bnlg1439的指纹中，来自内蒙古民族大学农学院的P138的分子量约为90bp，而义县种子公司提供的P138则为200bp和90bp；再如在引物phi084扩增的指纹中，内蒙古民族大学农学院提供的P138分子量为134bp，而义县种子公司提供的P138分子量为173bp，此外出现差异的引物还有Bnlg197和umc2048，其指纹差异见图1。 　　2.自交系Mo17的DNA指纹分析 　　三份自交系Mo17分别由内蒙古硕丰种业、锦州种子公司和义县种子公司提供。在本试验中，共发现5对SSR引物扩增后出现了DNA指纹的差异。在引物bnlg1439的扩增指纹中，出现了谱带数目的差异。来自内蒙古硕丰种业和义县种子公司的Mo17谱带相同，均为150bp和90bp，而由锦州种子公司提供的Mo17仅有90bp一条谱带。在引物bnlg1613扩增的指纹中，Mo17存在位置上的差异：由内蒙古硕丰种业和锦州种子公司提供的Mo17分子量大小为165bp，而义县种子公司提供的Mo17分子量大小为124bp，此外出现差异的引物还有phi065、Bnlg197和bnlg161，其指纹差异见图2。 　　3.自交系65232的DNA指纹分析