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普伐他汀对培养人内皮祖细胞药理作用影响 　　[摘要] 目的 观察普伐他汀对培养人内皮祖细胞（EPC）数量、增殖、迁移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影响。 方法 采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，贴壁筛选法培养内皮祖细胞，培养7 d后收集细胞并分别加入普伐他汀10 μmol/L及100 μmol/L，干预48 h， 免疫组化、荧光显微镜和流式细胞仪鉴定内皮祖细胞， 分别观察内皮祖细胞的数量、增殖迁移黏附能力、细胞内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA 的表达以及培养液中NO的水平。 结果 普伐他汀组促进外周血内皮祖细胞扩增，并显著改善外周血内皮祖细胞的黏附、迁移、增殖以及eNOS mRNA 表达和NO 合成的能力。 结论 他汀类药物可增加培养人内皮祖细胞数量并改善其功能。 　　[关键词] 普伐他汀；内皮祖细胞；细胞培养 　　[中图分类号] R965 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2013）06-0016-03 　　他汀类药物是目前临床上最常见的血脂调节药物，广泛应用于动脉粥样硬化、高脂血症等疾病的防治，其作用机制为抑制胆固醇合成途径的HMG-CoA还原酶，从而降低低密度脂蛋白胆固醇水平。近年来研究发现，其除降脂作用外还存在非降脂作用，比如能改善血管内皮功能，上调成熟血管内皮细胞eNOS的活性和NO的合成[1]。内皮祖细胞（EPC）作为血管内皮的前体细胞，具有血管内皮细胞相似的特性，不仅参与新生血管形成（angiogenesis）以及出生后血管生成（vasculogenesis），而且参与损伤内皮的修复，在血管内皮功能中扮演着重要的角色。为进一步研究他汀类药物改善内皮功能的机制，本实验观察了普伐他汀对体外培养的内皮祖细胞数量和功能的影响。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与试剂 　　实验血样取自成年健康男性志愿者外周血约80 mL。普伐他汀由浙江大学医学院心血管病研究所赠予。MTT试剂、培养基M199（Sigma公司），FITC-抗钙黏着蛋白单克隆抗体（VE-Cadherin，Bender system TM 公司），PE-抗CD34单克隆抗体（CALTAG LABORATORIES），FITC-抗CD133单克隆抗体（RD公司）， PE-抗VEGFR-2单克隆抗体，Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL，Molecular Probe公司），Ⅷ因子相关抗原免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），改良的Boyden 小室（江苏海门麒麟医用仪器厂），RT-PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司），内皮型一氧化氮合成酶 PCR引物（上海生物工程有限公司），GAPDH引物（Clontech公司），NO测试盒（南京建成生物工程研究所）。其余为市售试剂。 　　1.2 方法 　　1.2.1 EPC的培养和鉴定 取成年健康男性新鲜外周血80 mL，加等体积Hank’s液稀释并混匀后采用离心法获取单个核细胞，将细胞接种于包被纤维连接蛋白的24孔培养板中，M199培养基（包含有VEGF 10 ng/mL、20%胎牛血清、链霉素100 IU/mL及青霉素100 IU/mL）中培养，3 d后洗去未贴壁的悬浮细胞，更换相同培养液继续培养。 　　0.25%胰酶消化培养第6天贴壁细胞，制成单个细胞悬液，应用流式细胞仪分别检测细胞VE-Cadherin、VEGFR-2、CD34及CD133表达。培养第6天将细胞与终浓度2.4 μg/mL 的Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）避光共孵育4 h，洗去培养液后荧光显微镜下观察细胞荧光来检测细胞对Dil-ac-LDL的摄取。细胞Ⅷ因子相关抗原的表达采用免疫组化法测定。根据细胞形态、流式细胞术、荧光细胞化学染色、免疫组化等结果，综合判定培养细胞是否为人内皮祖细胞。 　　1.2.2 分组 将培养第7天的各孔细胞消化下来并接种到24孔培养板上，接种密度为1×104/cm2。随机分为3组：① 常规培养液的对照组，②10 μmol/L普伐他汀条件培养液的干预组，③100 μmol/L普伐他汀条件培养液的干预组。每组6孔，培养48 h后，进行数量和功能的测定。 　　1.2.3计数EPC数量 在显微镜下对各孔具有典型内皮细胞形态的贴壁纺锤形细胞进行计数（×200各孔取上下左右中5个视野）。 　　1.2.4 检测EPC黏附能力 消化各组贴壁细胞，重悬浮于1 mL培养液中，并计数，然后以同等数目接种在培养板上，培养30 min，洗去未贴壁细胞，计数贴壁细胞数。 　　1.2.5 检测EPC增殖能力 消化各组贴壁细胞，重悬浮于1 mL培养液中，再将相同数目细胞接种到96孔培养板，每孔加10 μL MTT，培养4 h后，吸弃上清液，再