检测细胞中1―磷酸鞘氨醇含量LC―MSMS分析方法建立.docVIP

检测细胞中1―磷酸鞘氨醇含量LC―MSMS分析方法建立 　　[摘要] 目的 建立并确证可以检测1-磷酸鞘氨醇（S1P）快速、灵敏、特异的LC-MS/MS定量分析方法。 方法 采用C17-S1P作为内参，甲醇一步法进行蛋白沉淀，随后进行正相电喷雾离子化LC-MS/MS分析。流动相为甲醇-0.1%甲酸水（95∶5，v/v），流速0.2 mL/min，每个样品的分析时间为4 min。细胞经TNF-α处理后S1P含量显著增加；而经DMS处理后S1P含量显著下降。 结果 S1P的标准曲线线性范围为0.1～10 ng/mL。相关系数r2均大于0.989。 结论 该方法可以快速，灵敏，特异性地同时检测生物样品中S1P的含量。 　　[关键词]含量测定；1-磷酸鞘氨醇；液质联用 　　[中图分类号] R743.3 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）09-09-03 　　鞘磷脂不仅是细胞膜的主要成分，也可作为信号分子调控多种细胞进程，包括细胞增殖，分化，存活，死亡以及一些细胞的炎症反应[1-2]。几种磷脂类代谢物，特别是鞘氨醇（Sph）和1-磷酸鞘氨醇（S1P）被认为是具有显著生物活性的关键分子，控制着细胞生存和死亡。S1P可以被S1P磷酸酶去磷酸化为Sph。Sph作为负性调节因子，抑制细胞增殖和促进凋亡。相反，S1P作为Sph的磷酸化产物，参与了促进细胞增殖和抑制凋亡过程[3]。目前已有一些方法用于测定生物样品中低丰度的S1P含量。这些方法包括放射性同位素掺入酶促反应实验[4]，放射性受体结合实验[5]，HPLC柱前衍生化[6-7]，质谱[8-9]以及LC-MS/MS等。 　　在本研究中，我们建立了一种快速，简便，灵敏的LC- 　　MS/MS分析方法。本方法成功地测定了HEK293细胞中S1P的含量。 　　1 仪器与试药 　　Finnigan TSQ Quantum三重四极杆质谱仪（Thermo Electron，San Jose，CA，USA），色谱分析柱为Luna-RP C18色谱柱（150 mm L×2 mm i.d.，5 μm particle size and 100 ? pore size）；外加C18保护预柱（4.0 mm L ×2.0 mm i.d.）（Phenomenex，Torrance，CA，USA）。D-erythro-1-磷酸鞘氨醇（S1P），C17-d-erythro-1-磷酸鞘氨醇（C17-S1P）购自Avanti Polar Lipids（美国）。S1P和C17-S1P的贮存液[DMSO/浓盐酸（100∶2，v/v）]配制，浓度均为100μg/mL。用甲醇配制并于-20℃保存。实验时贮存液用甲醇进一步稀释成工作液。HPLC级甲醇和甲酸购自Tedia公司（美国）。其他所有有机溶剂和化学品均为分析纯级。TNF-α购自BioSource（美国）；二甲基鞘氨醇（DMS）购自Biomol Research Laboratories公司（美国）；超纯水由Milli-Q plus水纯化设备提供（美国）。 　　2 方法和结果 　　2.1 色谱条件 　　溶剂及样品经Finnigan自动进样器和质谱泵进行分离。柱温为25℃。流动相为甲醇-水（95∶5，v/v）（水中含0.1%甲酸）；流速为0.2 mL/min。每个样品的分析时间为4 min。流动相调控色谱行为和恰当的离子化。为了摸索最优流动相条件，我们研究了不同比例的甲醇，乙腈和水对实验的影响。乙腈能够降低样品的分析时间，每个样品可以在2 min内分析完毕，但峰型比较宽，有一定的脱尾。而增加液相中甲醇的比例可以改善灵敏度和峰型，尽管分析时间长了一些。此外，加入少量甲酸可以提高灵敏度和改善峰型。最终，本实验摸索的最优流动相组成为：95%甲醇和5%甲酸水（甲酸水中含有0.1%的甲酸）。在该流动相条件下，每个样品在4 min内分析完成。 　　2.2 质谱条件 　　2.3 细胞培养 　　人胚胎肾细胞293（HEK293）培养在含10%（v/v）胎牛血清，2 mM谷氨酰胺，0.2%（w/v）碳酸氢钠，100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基中。细胞于37℃，5% CO2培养箱中培养，细胞长至汇合状时，采用0.25%胰酶进行消化传代。 　　2.4 样品收集和制备 　　2.5 制备标准品 　　2.6 方法学考察 　　3 讨论 　　S1P作为磷脂类小分子化合物，其在生物体内的含量较低。最早人们采用放射自显影技术进行S1P含量测定。该实验采用放射性标记的底物[γ-32P]ATP进行体外酶促反应，随后采用有机溶剂抽提和TLC分离，再用放射自显影方法捕捉产物信号，最后采用液闪仪或磷屏扫描进行定量分析[4]。另一种